球孢白僵菌Pr1蛋白酶基因cDNA克隆与序列分析

从球孢白僵菌菌株Bb202中克隆了昆虫蛋白酶Pr1的基因。使用特异性引物,分别以基因组DNA和mRNA为模板进行PCR反应,得到了球孢白僵菌的Pr1蛋白酶基因cDNA和结构基因序列。测序结果表明球孢白僵菌Pr1蛋白酶结构基因全长大小为1606bp,含有3个内含子,分别为69、61和68bp。其ORF全长1140bp,预测编码379个氨基酸残基。成熟蛋白理论分子量为38.8kD,理论等电点为8.06。为进一步研究球孢白僵菌Pr1基因,并构建高毒力工程菌株提供了理论基础。     

玫烟色棒束孢几丁质酶的转基因球孢白僵菌菌株的获得及其对马尾松毛虫的毒力增效作用

本文根据GenBank中已登录的蜡蚧蚧霉Lecanicillium lecanii,粉棒束孢Isaria farinosa,球孢白僵菌Beauveria bassiana和金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae的几丁质酶基因序列的同源性比较, 以它们高度保守的核苷酸序列设计一对引物,采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法,首次从玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea中克隆出几丁质酶Ifuchi1全长cDNA基因。其全序列长为1 542 bp,编码阅读框由1 275个核苷酸组成, 5′非翻译区（5′-UTR）与3′非翻译区（3′-UTR）分别为33个核苷酸和234个核苷酸。基因编码424个氨基酸, 信号肽长度为24个氨基酸, 成熟蛋白理论分子量为47.6 kDa,理论等电点为4.89。该蛋白可归于几丁质酶18族V类。运用制备芽生孢子转化法将Ifuchi1基因导入球孢白僵菌。最适产酶时间36 h条件下, 挑选的转基因菌株的几丁质酶活性相对于野生型菌株提高了86.2%;在对马尾松毛虫的生物测定中,在孢子浓度为1×10⁷个孢子/mL时,与野生型菌株Bb13相比,转基因菌株的致死中时间LT₅₀平均缩短了29%,同时死亡率提高了52.9%;野生型菌株和转基因菌株致死中浓度LC₅₀分别为4.71×10⁶ 个孢子/ mL和1.74×10⁶ 个孢子/ mL,降低了约1.7倍的剂量,故通过基因工程方法获得的转基因工程菌株显著地提高了球孢白僵菌的杀虫效率。     

竹黄菌液体培养下产竹红菌素的研究

先对不同产地采集的竹黄菌进行筛选,得到优产竹红菌素的菌株,然后采用单因子和3因素3水平正交试验法对竹红菌素液体发酵条件进行优化,在优化培养基的基础上,选用不同浓度的Cr3+、Fe3+、Cu2+和Ca2+对竹红菌素进行离子调控研究。结果表明:从休宁所采集的菌株不仅生长速度最快,发酵所产的竹红菌素含量也最高;竹红菌素最佳发酵碳源是葡萄糖,最佳发酵氮源是硝酸钠,最佳培养基组合为2%葡萄糖,0.2%硝酸钠,pH7.5;Cr3+和Fe3+浓度为0.005%时竹红菌素含量均最高;0.05%的Ca2+最有利于竹红菌素的分泌;Cu2+为0.03%时竹红菌素含量达到最大值。     

大肠杆菌DH5α菌株感受态制备及转化率变化研究

通过氯化钙法制备大肠杆菌DH5α菌株感受态,讨论了不同保存温度和保存时间对感受态转化率的影响。结果表明,在4℃下保存,8h达到最高转化率;在-20℃和-70℃下保存,均为48h达到最高转化率。通过氯化钙法制备的DH5α菌株感受态细胞,在-20℃条件下简单保存,20d内完全可以满足一般转化研究的要求,不需要复杂的甘油、液氮处理及超低温要求。     

球孢白僵菌tps2基因的克隆和生物信息学分析

运用SMART RACE RT-PCR技术与DNA步移技术,首次从球孢白僵菌中克隆出完整的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶TPS2的基因编码区序列及上游序列。该基因cDNA全长3219 bp,其中开放阅读框（ORF）2619 bp,编码872个氨基酸。成熟蛋白理论分子量为97.8 kD,理论等电点为6.32。编码框结构基因的全长为2821 bp,有两个长度分别为140 bp和62 bp的内含子。分析表明,上游序列中含有TATA-box、CAAT-box和GC-box,并且也存在GATA元件等启动子顺式调控元件。本文结果将为进一步研究海藻糖在虫生真菌中的生理合成以及抗逆调控机制奠定坚实的基础。     

实时荧光定量PCR检测球孢白僵菌热休克蛋白基因hsp70在几种胁迫条件下的表达

本研究运用Realtime-PCR技术,对球孢白僵菌Beauveria bassiana hsp70基因在不同胁迫条件下的表达情况进行了检测。从mRNA转录水平探讨了不同胁迫条件对球孢白僵菌hsp70基因表达的影响。结果表明:38℃高温胁迫下,30min时表达量达到最高峰,为对照样品的10.18倍。随后表达量开始下降,至180min时,其表达量降为最低,为对照样品的2.85倍;4℃低温胁迫下,2h检测到hsp70的表达量下降至最低点,为对照样品的0.25倍。随后表达量开始回升,至10h表达量始终维持在对照样品的1.4-1.5倍左右;紫外胁迫下(波长253.7nm),3min后hsp70的表达量快速上升至最高峰,为对照样品的2.33倍。随后表达量迅速下降,至60min表达量始终维持在对照样品的0.2倍左右。因此推测,hsp70基因在球孢白僵菌抵抗高温、低温和紫外三种胁迫方面都可能具有重要作用。同时研究结果也表明,球孢白僵菌hsp70基因启动子在逆境下可引导基因高效表达,因而在抗逆工程菌株构建方面可能具有重要的应用价值。