山东省甲型H1N1流感病毒病原学及基因特性研究

在2009~2010年监测年度开展甲型H1N1流感病毒学监测并进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况。采集了17 126份发热患者的鼻、咽拭子标本,采用逆转录实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)进行核酸检测,其中甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性4004份,总阳性率为23.38%。对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序。利用DNAStar软件对序列进行同源性分析发现与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株HA、NA基因同源性分别为96.9%~99.3%和99.1%~99.6%;利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析发现,与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株有21个血凝素基因的氨基酸发生替换,其中11个氨基酸位点位于抗原决定簇区,一个糖基化位点发生改变;有16个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,一个糖基化位点发生改变;未发生神经氨酸酶蛋白275位H→Y的替换。结果显示山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变,所有病毒均对达菲类药物敏感。     

2008～2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因特性分析

为了解2008~2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因变异情况,选择珠海市2008~2009年期间不同时间点的经狗肾传代细胞(MDCK)培养分离的H3N2亚型流感毒株20株,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增HA1基因片段,将产物纯化并测序,推导氨基酸序列,进行基因进化特性分析。与同时期的疫苗株比较,2008年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇的氨基酸位点变异数少于4个;2009年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株除09-0056外,HA1区存在5个位于抗原决定簇内的变异氨基酸位点。2008年H3N2亚型流感毒株的HA1区的糖基化位点与疫苗株一致;2009年H3N2亚型流感毒株HA1区丢失第144位糖基化位点。2008~2009年H3N2亚型流感毒株RBS氨基酸序列未见明显变异。与2008年H3N2亚型流感毒株比较,2009年H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇内存在多个位点的氨基酸替换。这些说明2008年珠海市流行的H3N2亚型流感病毒不是新变种;2009年流行的H3N2亚型流感病毒为新的变异株,这可能是H3N2亚型流感病毒在2009年6-9月为珠海地区季节性流感流行优势株的原因。     

1981～2005年中国H1N1甲型流感病毒血凝素基因的HA1演变特征

为了解1981~2005年我国H1N1甲型流感病毒血凝素基因的HA1演变特征,选取H1N1甲型流感病毒370株,提取病毒RNA,经逆转录和聚合酶链反应扩增HA1并测序,测定的序列用生物信息软件分析,与GenBank中相关序列比较,并对推导的编码氨基酸序列进行基因特性分析。结果表明:HA1氨基酸的变异表现为抗原决定簇4个区均有变异,Sb区和Ca区变化较大;HA1受体结合位点(RBS)的前壁130环的第134位赖氨酸从1991年起在部分毒株HA1序列上开始缺失,以后缺失株逐步增多,自2000年起测定的所有毒株上该氨基酸全部缺失,同时这些缺失株的第137位氨基酸也全部由苏氨酸替换为丝氨酸;糖基化位点从增多到减少,最后稳定在7个;1981~2004年我国H1N1甲型流感病毒血凝素HA1编码的氨基酸在种系发育树上同年代基本呈现集中分布,与时间和地域无关,2005年毒株分成两个分支在时间上有明显差异。     

一株2011年出现的季节性甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因特性的研究

本文通过比较2011年分离培养的1株季节性甲型H1N1流行性感冒(简称流感)病毒(A/Shanghai/1167/2011(H1N1))与历年季节性甲型H1N1流感病毒的血凝素(HA)基因,追溯该病毒的基因变异与来源,探讨该毒株的出现对流感防控工作的意义.采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增病毒的HA和神经氨酸酶(NA)片段,并进行测序;应用分子生物学软件对获得的序列进行分析,绘制基因进化树;同时,通过血凝抑制试验检测2011年下半年健康人群中该流感病毒的抗体水平.结果显示,A/Shanghai/1167/2011(H1N1)的HA基因序列与世界卫生组织(WHO)2007～2008年季节性甲型H1N1流感病毒疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)最接近,同源性达99.2%,与新型甲型H1N1流感病毒A/California/07/2009疫苗株同源性仅为72.4%.其HA基因裂解位点为PSIQSR↓GLF,尚未出现高致病性的分子特征.HA片段共编码557个氨基酸,有9个潜在的糖基化位点,序列与2009年前WHO疫苗株A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)、A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)和/Brisbane/59/2007(H1N1)相比,分别有15、12和4处不同,这些差异分布在Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb 5个抗原决定簇的氨基酸差异分别有5、5和2处.该毒株在健康人群血清的抗体阳性率为34.33%,几何平均效价(GMT)为10.38.A/Shanghai/1167/2011(H1N1)是2011年出现在上海地区的一个季节性甲型H1N1流感病毒毒株,其抗原变异与既往季节性甲型H1N1流感病毒相比不大,但在以A(H1N1)pdm09为主要流行株的年份检测到散在发生的既往季节性甲型H1N1流感病毒毒株应当引起重视,其在人群中的抗体水平较低,易引起流行,需要提高对类流感人群中此种毒株的持续监测.     

2009−2015年中国甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

【目的】为了解中国地区2009?2015年甲型H1N1流感病毒流行态势,分析血凝素(Hemagglutinin,HA)基因的变异情况及其遗传进化特征。【方法】汇集国家流感中心2009?2015年流感周报的流感流行数据,分析甲型H1N1流感的流行病学特征;从全球共享禽流感数据倡议组织数据库及美国国家生物技术中心数据库下载甲型H1N1流感病毒HA基因序列,采用生物学软件进行系统进化和遗传特性的分析。【结果】2009?2015年全国共发生4次甲型H1N1流感的流行高峰。2009?2015年毒株与参考毒株A/California/07/2009(H1N1)的HA基因同源性逐年降低。遗传进化分析显示同一年份的毒株在系统进化树上基本呈现集中分布,2011年的毒株独立形成2个分支。分子特征表现为HA基因的4个抗原决定簇氨基酸位点均有变异,其中Ca区的203位、Sa区的163位和Sb区的185位氨基酸位点逐渐替换为新的氨基酸。除2010年与2012年,其他年份的毒株通过不同模型均得到正向压力选择HA氨基酸位点240。【结论】甲型H1N1流感在中国地区成为主要流行的亚型之一。HA基因与其编码的氨基酸逐年变异,未来进一步的流感监测能力还需加强。     

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定

目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。     

甲型H1N1流感监测及其HA1基因特性分析,以2013~2014年新余市为例

因HA基因的头部重链区(HA1)是流感病毒的抗原位点和受体结合位点,所以了解流感病毒的HA1基因特性可以评估当前WHO推荐的疫苗株的预防效果。本文选取新余市2013~2014年通过狗肾传代细胞(MDCK)培养分离到的H1N1流感毒株12株,提取病毒RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HA1基因片段。对序列分析发现2013~2014年新余市甲型H1N1流感病毒HA1基因序列与疫苗推荐株有较高的同源性,核苷酸同源性97.9%~98.5%。2013年的6株毒株HA1区与疫苗株比较,氨基酸变异位点7~11个,其中3株有2个变异位点在不同的抗原决定簇区。而2014年毒株单独集中在进化树的一支。以上提示,目前流感疫苗对2014年的流感人群仍有保护作用,对2013年的部分流行的H1N1预防效果有限;甲型H1N1爆发流行的可能性很大,应加强防控。     

一种含不同流感病毒血凝素抗原表位的核酸疫苗

流感病毒表面抗原血凝素( hemagglutinin,HA)是流感核酸疫苗重要的靶抗原,针对HA的保护性中和抗体主要由HA上的五个抗原表位诱导产生.在本文中,我们构建了一种以新甲型H1N1流感病毒HA1为骨架的含2个A/PR/8( H1N1)流感病毒HA抗原表位和3个新甲型H1N1流感病毒HA抗原表位的核酸疫苗,并在B...     

A(H3N2)亚型流感病毒血凝素基因特性及蛋白结构分析,以南宁市2009～2012年为研究案例

利用生物信息学软件和数据库研究南宁市2009~2012年度A(H3N2)亚型流感病HA基因的遗传变异规律及蛋白结构变化。通过RT-PCR扩增H3N2病毒HA基因并测序,同源比对统计毒株氨基酸位点的差异、构建系统进化树分析进化规律和同源建模分析蛋白结构的变化。系统进化树表明53株HA基因序列被分为4个类群,呈多侧支流行;所有毒株的二硫键和受体结合位点(RBS)高度保守;部分毒株HA在第45位点增加一个糖基化位点,在第144位点丢失一个糖基化位点;HA抗原决定簇氨基酸累计有30个位点发生变异,涉及5个抗原决定簇;HA晶体结构分析抗原决定簇突变位点主要发生在无规则卷曲处,大多数替换的氨基酸种类和性质相同或相似。南宁市A(H3N2)亚型流感病毒株变异活跃,2012年A(H3N2)亚型流感病毒与当年WHO推荐的疫苗株具有较远的进化距离,多数毒株具备了形成新变种的条件,是否形成新的流行株,有待深入研究。     

江苏首例甲型H1N1(2009)流感病毒分离及其血凝素分子遗传特征分析

2009年6月12日,江苏确诊首例甲型H1N1(2009)病例。通过细胞和鸡胚分离系统,我们分离到一株具有较高血凝活性的病毒,命名为A/Jiangsu/1/2009。为了跟踪病毒的变异情况,我们开展了病毒的全基因组测序工作,在此基础上对其血凝素基因(Haemagglutinin,HA)的遗传特性进行了详细研究。分离株HA蛋白不具有多碱基HA裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与参考株A/California/04/2009相比,分离株A/Jiangsu/1/2009HA蛋白的有4个氨基酸发生了突变,但都不在已知的抗原位点上。分离株有5个潜在糖基化位点,这与近年来古典猪H1N1和北美三源重配猪H1病毒完全一致,保留了古典猪H1的特点。与禽流感H1病毒相比,分离株HA蛋白受体结合位点上的E190D和G225D发生突变,这可能成为新甲型H1N1(2009)在人际间传播的一个重要分子基础。此外,其它受体结合位点上相关氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。本研究首次对早期流行的甲型H1N1(2009)流感病毒的HA蛋白的分子遗传特征进行了详细研究,对进一步监测病原变异具有重要指导意义。     

长沙A(H1N1)亚型季节性流感暴发疫情的实验室诊断及其HA基因特性分析

对2009 年长沙麓山国际学校流感暴发疫情进行实验室诊断, 并探索新分离的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素(HA)的基因特性。对流感暴发疫情的25 份鼻/咽拭子标本进行RT-PCR检测和流感病毒分离, 然后利用CEQ?8000 Genetic Analysis System对病毒分离株(A/Yuelu/314/2009)进行测序, 测序结果提交至GenBank(登录号: FJ912843)并用ClustalX和Mega4.1软件进行序列分析。结果显示, 分离出A(H1N1)亚型流感毒株18株, 检出21份A(H1N1)亚型流感病毒核酸阳性; A/Yuelu/314/2009(H1N1) HA基因序列与2008~2009 年疫苗株(A/Brisbane/59/2007)比较显示: 核苷酸和氨基酸同源性均为99%, 有6个位点的氨基酸发生了变异(V148A、S158N、G202A、I203D、A206T、W435R), 其中一个S158N氨基酸变异位于B抗原表位, HA基因序列上共有潜在糖基化位点9 个(27、28、40、71、151、176、303、497、536), 与A/Brisbane/59/2007相同且氨基酸序列保守。本实验诊断出此次流感暴发疫情的病原体为A(H1N1)型季节性流感病毒, 研究还发现A/Yuelu/314/2009(H1N1)长沙分离株与A/Brisbane/59/2007 疫苗株基因序列比较显示并未形成一个新的变种, 推测是由于分离株与疫苗株之间基因特性的改变和人群对A(H1N1)亚型流感病毒免疫力降低导致了此次长沙麓山国际学校A(H1N1)亚型流感的暴发。     

H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸序列的变异分析

从GenBank上获得194株不同来源的H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸序列,利用MEGA3分析了HA基N核酸序列碱基突变的特点。并通过比较序列同源性,构建NJ系统进化树,探讨了不同来源的H5N1病毒的系统进化关系。序列分析结果表明,被研究的194条H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸序列,碱基长度大约在1700bp左右,共发现了757个可变位点,其中Parsimony—informative sites有537个,Singleton sites有220个;病毒的变异速率很快,平均变异率为3．23％;病毒的序列变异具有显著的地区特点和时间特点;同时,全球化的贸易以及候鸟的迁徙在传播病毒过程中起一定作用。     

一株H5N1亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2004年1月湖北宜昌某鸡场暴发疫病,从该鸡场濒死鸡肺组织中分离到了一株病毒,电镜切片观察到典型的禽流感病毒粒子;采用ELISA检测禽流感抗原为阳性;RT-PCR扩增HA、NA基因并测序,经BLAST分析,HA基因与A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)HA基因同源性为97％;NA基因与A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)NA基因同源性为96％,确定该分离株为禽流感病毒H5N1亚型(A／Chicken／Yichang／Lung-1／04(H5N1))。     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

Hemagglutinin protein of Asian strains of human influenza virus A H1N1 binds to sialic acid--a major component of human airway receptors

Hemagglutinin (HA) protein plays an important role in binding the influenza virus to infected cells and therefore mediates infection. Deposited HA sequences of 86 Asian strains of influenza A (H1N1) viruses during the first outbreak were obtained from the NCBI database and compared. Interaction of the HA protein of influenza A (H1N1) virus with the human sialic acid receptor was also studied using bioinformatics. Overall, not more than three single-point amino acid variants/changes were observed in the HA protein region of influenza A (H1N1) virus from Asian countries when a selected group sequence comparison was made. The bioinformatics study showed that the HA protein of influenza A (H1N1) binds to the sialic acid receptor in human airway receptors, possibly key to air-borne infection in humans.     

A/swine/H1N1流感病毒中国分离株血凝素进化分析

2009年3月以来,甲型H1N1病毒已在全球包括中国造成了巨大的危害,所以利用生物信息技术对其进行研究显得十分必要。从NCBI数据库下载中国大陆境内A/swine/H1N1病毒HA基因核酸序列及其编码蛋白序列,利用MEGA4.0软件对核苷酸编码序列构建系统进化树,利用BioEdit软件对蛋白序列进行比对,分析重要抗原位点变异情况,结果显示2010年在广东流行的病毒,从其他地方传播到广东的,而非早期广东流行的的病毒变异而来。2008年福建,山东,北京等地区的病毒传播比较迅速.这些分析结果阐明了中国大陆境内A/swine/H1N1病毒血凝素(HA)基因的进化关系和变异趋向,对于研究A/swine/H1N1病毒具有重要的参考价值。     

Envelope Proteins Pertain with Evolution and Adaptive Mechanism of the Novel Influenza A/H1N1 in Humans

The novel swine-origin influenza A/H1N1 virus (S-OIV) first detected in April 2009 has been identified to transmit from human to human directly and is the cause of currently emerged pandemic. In this study, nucleotide and deduced amino acid sequences of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) of the S-OIV and other influenza A viruses were analyzed through bioinformatic tools for phylogenetic analysis, genetic recombination and point mutation to investigate the emergence and adaptation of the S-OIV in human. The phylogenetic analysis showed that the HA comes from triple reassortant influenza A/H1N2 and the NA from Eurasian swine influenza A/H1N1 indicating HA and NA to descend from different lineages during the genesis of the S-OIV. Recombination analysis nullified the possibility of occurrence of recombination in HA and NA denoting the role of reassortment in the outbreak. Several conservative mutations are observed in the amino acid sequences of the HA and NA and this mutated residues are identical in the S-OIV. The results reported herein suggested the notion that the recent pandemic is the result of reassortment of different genes from different lineages of two envelope proteins, HA and NA which are responsible for antigenic activity of virus. This study further suggests that the adaptive capability of the S-OIV in human is acquired by the unique mutations generated during emergence.     

Phylogenetic analyses of pandemic influenza A (H1N1) virus in university students at Tobetsu, Hokkaido, Japan

Pandemic influenza H1N1 virus (A[H1N1]pdm09) emerged in 2009. To determine the phylogeography of A(H1N1)pdm09 in a single population, 70 strains of the virus were isolated from university students or trainee doctors at Tobetsu, Hokkaido, Japan, between September and December 2009. The nucleotide sequences of the HA1 region of the HA genes and described phylogenetic relationships of the strains circulating among them were analyzed. It was found that the 70 isolates could be phylogenetically separated into three groups and that two epidemics were caused by different groups of the virus. The three groups were also distinguishable from each other by three amino acid changes: A197T, S203T and Q293H. The substitution of S203T, which is located in the antigenic site, suggests antigenic drift of the virus.