基于等电聚焦-反相HPLC的虎纹捕鸟蛛毒素组学的初步研究

虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)是中国最毒的蜘蛛之一.已有研究表明,其粗毒中含有丰富的低分子量(<10 kD)多肽活性成分.为分析这些成分, 利用目标蛋白快速分离系统(ProteomeLab PF 2D)建立了一种新的二维液相色谱分离方法.该方法包括一维的基于蛋白质等电点(pI)的色谱聚焦分离和二维利用无孔硅胶反相柱的基于疏水性的高效液相色谱分离.得到的反相图谱通过仪器配套的ProteoVue软件转换成与凝胶电泳图像相似的pI/UV图,以更直观地显示多肽成分的数量、分布规律及相对丰度等.洗脱的多肽自动收集后用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱进行分析.从一维分离的11个馏分(pH 4.53-8.59)中共检测到大约600个多肽条带.通过质谱分析测得130个多肽的精确分子量,同时通过De novo测序得到26种多肽(其中包括12种已知多肽)的部分序列信息,并利用这些序列信息对未知多肽进行了生物信息学分析.     

抗HIV融合多肽CP32M的制备工艺研究

目的:研究抗HIV融合多肽CP32M的制备工艺,为其临床前试验奠定基础。方法:采用固-液相混合策略规模合成目标肽,用离子交换色谱、反相高效液相色谱对粗肽进行纯化。结果:获得了利于提高合成及片段缩合效率的3条优选片段,CP32M粗品经DEAE离子交换色谱及C18反相纯化后纯度高于98%。结论:CP32M按3条片段(Ac-1-9-OH、Fmoc-10-21-OH、H-22-32-NH2)划分,可显著提高片段合成及缩合效率,DEAE阴离子交换色谱能除去大部分杂质,提高了第二步C18反相色谱纯化效率。     

牦牛骨抗氧化肽的分离纯化及鉴定

为了分离纯化及鉴定牦牛骨胶原多肽,以得到具有DPPH自由基清除率的抗氧化肽。合成抗氧化肽,验证其对DPPH自由基清除率。牦牛骨胶原多肽经陶瓷羟基磷灰石柱层析和C18反相高效液相色谱层析后得到组分F11。当其质量浓度为1 mg/mL时,对DPPH自由基清除率为34.45%。用反相高效液相色谱-质谱联用对F11组分进行序列测定,得到氨基酸序列为GPAGPPGPIGNVGAPGPK和GKSGDRGETGPAGP AGPIGPVGAR的抗氧化肽,分子量分别为1 570.810 3 Da和2 160.104 Da。合成抗氧化多肽GPAGPPGPIGN VGAPGPK和GKSGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR,当其质量浓度为1 mg/mL时,对DPPH自由基清除率分别为16.59%和35.17%。本研究分离鉴定出牦牛骨抗氧化肽,牦牛骨可能成为一种潜在的抗氧化剂。     

天麻多肽的分离纯化研究

目的：研究生物多肽对生物机体的生命活动有益或生理作用。方法：对天麻（Gastrodiae elata B1．）初提液两次超滤（3kDa和1kDa超滤膜）,凝胶过滤和快速蛋白液相色谱（FPLC）分离纯化,以及反相高效液相色谱（RP-HPLC）对目标肽进行分析检测。结果：由Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析分析肽液,得到各肽组分的相对分子质量分布范围。FPLC和RP-HPLC分析第二峰结果表明,此多肽组分分别只由一种肽组成。结论：此多肽相对分子质量在2500Da左右,具有很好的亲水性。     

一种反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料结合质谱在蛋白质组学中的应用

为了提高蛋白质组的覆盖率,色谱分离将发挥重要作用,而色谱固定相更是关键.为此,本文采用"硫醇-烯"点击化学的方法制备了一种反相/弱阳离子交换混合模式色谱填料,期望通过其对多肽混合物的高效分离提高蛋白质质谱鉴定的覆盖率.为了对制备的混合物模式色谱填料的性能进行评价和应用,首先采用小分子混合物对制备的混合模式色谱填料进行表征,结果表明,这种填料具有反相和弱阳离子交换两种分离机制;再用这种混合模式色谱填料分离6条疏水性和理论等电点不同的标准肽段混合物,可将这6条肽段完全分离,而经典的C18反相色谱柱则不能将它们完全分离,说明对于疏水性质相似的肽段,可以根据其等电点的差异得到更好的分离,且由于在反相基团与基质间嵌合了具有亲水性质的基团,减弱了固定相的疏水性质,从而减弱了强疏水性肽段的不可逆吸附的作用.最后将这种固定相用于全蛋白酶切物的混合模式色谱离线分离结合反相色谱-串联质谱分析,对100μg Hep-G2细胞全蛋白酶切物进行分析,共鉴定到5924个蛋白,表明这种混合模式的色谱填料可用于蛋白质组的分离分析中.     

敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ的分离纯化与鉴定

从敬钊缨毛蛛（Chilobrachys jingzhao）粗毒中,通过阳离子交换色谱和反相高效液相色谱分离得到一种新的多肽神经毒素,命名为敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ（jingzhaotoxin-Ⅷ,JZTX-Ⅷ）.经MALDI-TOF分析表明该多肽分子质量为4 329.37 Da,结合氨基酸序列分析和RACE的cDNA快速扩增法得到了敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ的氨基酸序列和全长cDNA,序列为LFECSFSCDIKKNGKPCKGSGEKKCSGGWRCKMNFCVKV-COOH,其中6个半胱氨酸形成3对二硫键.敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ能阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递,经初步膜片钳实验分析,表明该多肽是一种钙离子通道抑制剂.     

虎纹蛙皮肤分泌物抗氧化二肽——Gln/Lys-Met的纯化及鉴定

目前已自青蛙皮肤分泌物中提取出多种属于“第三套抗氧化系统”的多肽,它们具有较强的抗氧化作用.本文从虎纹蛙皮肤分泌物中提取具有抗氧化活性的多肽物质,并检测其活性.利用电刺激虎纹蛙背部腺和耳后腺获得其皮肤分泌物,利用凝胶过滤色谱Sephadex G-50和反相高效液相色谱（reverse-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC）进行分离纯化.以2,2-二苯基-1-苦肼基（2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl, DPPH·）清除率为指标,测定多肽的抗氧化活性,经ESI- MS（electrospray ionization mass spectrometry）质谱测定该多肽的相对分子质量.结果显示,自虎纹蛙皮肤分泌物中获得一种具有抗氧化活性的二肽,其分子质量为0.277 kD,可能的氨基酸序列为Gln/Lys-Met.虎纹蛙皮肤分泌物中的该二肽是发挥抗氧化作用的重要组成部分.     

三种胰岛素在反相色谱上的保留行为与热力学性质

以C8 柱为固定相 ,5 4%～ 5 9%甲醇为流动相 ,在一个广泛的温度 10～ 6 5℃范围内 ,研究了人、牛、猪 3种生物的胰岛素在高效反相色谱上的保留行为和热力学性质。研究结果表明 3种胰岛素在结构上的细微差别 ,能在反相色谱行为上明显地显示出来。同时还测定了 3种胰岛素与C8 柱结合时的焓ΔHo 和熵ΔSo 变化情况 ,这些热力学参数 ,对多肽和疏水界面相互作用机制的研究具有重要的参考价值。实验结果证明 ,通过色谱热力学参数的测定 ,将为蛋白质折叠机制以及生物大分子相互作用机制的研究 ,提供一种极其有效的方法     

毛细管水解及反相高效液相色谱分析蛋白质的氨基酸组成

 毛细管水解及反相高效液相色谱分析蛋白质的氨基酸组成陈平,梁宋平（湖南师范大学生物研究所,长沙４１０００６）氨基酸组成的分析是阐明蛋白质和多肽化学特性的基础,在蛋白质与多肽的氨基酸组成分析中,常采用对水解管反复充氮并抽真空的方法使蛋白质和多肽在隔绝氧气...     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅵ的分离纯化及鉴定

从分布于我国海南省的海南捕鸟蛛（Selenocosmia hainana)粗毒中,应用阳离子交换色谱和反相高效液相色谱分离得到1种多肽神经毒素,命名为海南捕鸟蛛毒素－Ⅵ（Hainantoxin-Ⅵ,HNTX-Ⅵ)。MALDI－TOF南谱分析及氨基酸序列分析表明该多肽毒素分子量为3.998 49kDa,序列为NH2－ECKYLWGTCEKDE－HCCEHLGCNKKHGWCGWDGTF－COOH,其中的6个Cys形成3对二硫键。HNTX－Ⅵ能阻断小鼠膈神经膈肌标本神经肌肉接头传递,脑室及硬膜外注射毒能使小鼠瘫软。同源性搜索表明该毒素与蜘蛛Grammostola spatulata毒素HaTx和蜘蛛Scodra griseipes中的SGTx1毒素有很高的同源性,而后两种毒素均为K^ 通道阻断剂。     

包涵体纯化技术

20世纪90年代以来,基因重组技术得到很大的发展,基因工程产品的分离成本约占其全部成本的60%～80%,因此纯化技术越来越重要。着重介绍包涵体纯化技术,包括金属亲和层析,凝胶过滤层析,离子交换层析,疏水层析,双水相萃取技术和反胶团相转移技术近年来的进展情况。     

人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的表达及鉴定

化学合成人甲状旁腺激素（hPTH）全长基因,克隆到大肠杆菌表达载体pBV220和pET22b中,获得了高表达。经破菌、阳离子交换层析、反相层析纯化获得了纯度大于95%的纯品。N端测序、质谱分析结果表明重组hPTH 结果完整,N端无Met或fMet。生物活性试验证明重组hPTH具有激活腺苷酸环化酶、增加骨质量和骨密度等作用。     

Expression and characterization of LTx2, a neurotoxin from Lasiodora sp. effecting on calcium channels

Here, we described the expression and characterization of the recombinant toxin LTx2, which was previously isolated from the venomous cDNA library of a Brazilian spider, Lasiodora sp. (Mygalomorphae, Theraphosidae). The recombinant toxin found in the soluble and insoluble fractions was purified by reverse phase high-performance liquid chromatography (HPLC). Ca2+ imaging analysis revealed that the recombinant LTx2 acts on calcium channels of BC3H1 cells, blocking L-type calcium channels.     

Folding and refolding of proteins in chromatographic beds

The correct folding of solubilized recombinant proteins is of key importance for their production in industry. On-column refolding of proteins is mainly achieved by three methods: size-exclusion chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography using immobilized metal chelates. The principles of these methods were first laid down in the 1990s, but many recent improvements have been made to these processes including sophisticated changes to the mobile phase composition and the recycling of aggregates to improve yield. Advances have also been made in the use of immobilized metal affinity chromatography and by mimicking the natural folding process with artificial chaperones.     

Extracellular expression and single step purification of recombinant Escherichia coli L-asparaginase II

L-Asparaginase (isozyme II) from Escherichia coli is an important therapeutic enzyme used in the treatment of leukemia. Extracellular expression of recombinant asparaginase was obtained by fusing the gene coding for asparaginase to an efficient pelB leader sequence and an N-terminal 6x histidine tag cloned under the T7lac promoter. Media composition and the induction strategy had a major influence on the specificity and efficiency of secretion of recombinant asparaginase. Induction of the cells with 0.1 mM IPTG at late log phase of growth in TB media resulted in fourfold higher extracellular activity in comparison to growing the cells in LB media followed by induction during the mid log phase. Using an optimized expression strategy a yield of 20,950 UI/L of recombinant asparaginase was obtained from the extracellular medium. The recombinant protein was purified from the culture supernatant in a single step using Ni-NTA affinity chromatography which gave an overall yield of 95 mg/L of purified protein, with a recovery of 86%. This is approximately 8-fold higher to the previously reported data in literature. The fluorescence spectra, analytical size exclusion chromatography, and the specific activity of the purified protein were observed to be similar to the native protein which demonstrated that the protein had folded properly and was present in its active tetramer form in the culture supernatant.     

啤酒酵母生产的重组水蛭素的纯化及脱色

对啤酒酵母生产的重组水蛭素变异体1(rHV1)进行多步骤的纯化。首先将分泌到培养上清液中的水蛭素进行硫酸铵沉淀和SephadexG-50凝胶过滤,再用Q-SepharoseHP阴离子交换层析分离,最后用HPLCSP-5PW阳离子交换柱脱色及HPLCC8柱反相层析。真空干燥后得到的水蛭素蛋白经SPS-PAGE、N端氨基酸序列分析、抗凝血酶活力分析鉴定,证明已获得高纯度的重组水蛭素HV1制剂,为利用基因工程方法生产重组水蛭素的规模化生产及临床应用提供了依据     

人源性抗HBsAg Fab抗体的发酵生产研究

为了适应工业生产的需要,利用fed—batch方法,重组人源性抗HBsAg Fab抗体酵母工程菌在30L发酵罐中进行了高密度发酵,发酵最适温度30℃,pH值范围5．0～5．3,溶氧范围20％～30％。发酵液OD600值达到300时开始诱导,甲醇最佳诱导浓度为10mL／L。重组人源性抗HBsAg Fab抗体经离子交换层析纯化,纯化产品经SDS-PAGE、Western blot进行分析和ELISA方法进行活性测定。结果显示,重组Fab抗体在Fed-batch发酵系统中可高效表达,经过192h的发酵生产,重组人源性抗HBsAg Fab抗体的表达量可达412mg／L。发酵上清经过离子交换层析纯化,获得纯度为95％的重组Fab抗体,该Fab抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力和特异性。结果证实可以通过高密度发酵毕赤酵母工程菌来高效生产重组人源性抗HBsAg Fab抗体,为后续的工业化生产应用奠定了基础。     

Extracellular insulin degrading activity creates instability in a CHO-based batch-refeed continuous process

In a batch-refeed continuous process involving a recombinant Chinese hamster ovary cell line, a brief upset was Occasionally observed during which cell growth halted and cell viability dropped. This was found to be associated with depletion of insulin from the medium early during the affected passage. Insulin depletion was found to be primarily the result of insulin degrading activity released by the cells during the preceding passage.Abbreviations CHO Chinese hamster ovary - rhM-CSF recombinant human macrophage colony stimulating factor - RIA radioimmunoassay - RP-HPLC reverse phase high performance liquid chromatography     

重组人胰高血糖素样肽-1类似物的分离纯化和鉴定

将合成的人胰高血糖素样肽-1类似物基因插入到原核表达质粒pGEX-4T-3中,构建成rhGLP-1类似物与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferases,GST）的融合表达载体pGEX-rhGLP-1类似物,转化大肠杆菌BL21（DE3）获得重组菌株。IPTG诱导表达的菌体经高压均质机破碎后,离心收集包涵体,经尿素变性、Glutathione-Sepharose 4B亲和层析、肠激酶酶切、SP-Sepharose FF层析和反相层析RP-C18脱盐后冻干,得到纯度大于96%的rhGLP-1类似物,经质谱测定,分子量与理论值一致。生物学活性分析表明,rhGLP-1类似物具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞cAMP增加的活性。     

聚乙二醇伴随式离子交换层析分离重组乙肝病毒表面抗原

对由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的多聚亚基蛋白HBsAg在离子交换层析过程中容易因亚基解离而导致蛋白解聚和丧失生物活性的难题,实验中选择聚乙二醇（PEG）作为保护剂伴随式（Polyethylene Glycol-Accompanied）离子交换层析分离纯化HBsAg。实验表明,在流动相中加入1% PEG10000(W/V)作为纯化伴侣, HBsAg的回收率由55% 左右提高到80%以上,纯化倍数基本保持在12左右。对纯化产物进行SDS_PAGE分析表明,1% PEG10000的纯化伴侣伴随式离子交换层析能全部保留HBsAg的糖基化蛋白单体（27kD和30kD）,高效液相色谱联用多角度激光散射(High Performance Size Exclusion Chromatography_Multiangle Laser Light Scattering, HPSEC-MALLS )进一步分析阐明了PEG能促使HBsAg颗粒尺寸分布更均一,结构更接近天然乙肝表面抗原。