巢湖微囊藻产毒株的分离、保存及种属特异性鉴定

利用平板划线结合液体培养的方法从巢湖分离得到一个藻株,命名为Chaohu-1。甲醇粗提该藻株所产生的藻毒素(MCs),经固相萃取、HPLC检测,证实该藻株产生毒性最强的Microcystin-LR。藻细胞呈绿色球状,群体为无规则网状。全细胞PCR扩增藻蓝蛋白基因间隔序列(PC-IGS),结果与GenBank中已有的铜绿微囊藻属序列相似性达99%。综合形态学和分子生物学的分析结果,表明我们首次从巢湖分离得到1个产毒的铜绿微囊藻藻株。同时我们摸索出该藻株冻存及复苏方法,为藻株的长期保存及后续研究打下了基础。     

非无菌培养的微小卡罗藻次生代谢产物的细胞毒及其宏基因组酮基合成酶基因的筛选

目的：检测微小卡罗藻（Karlodinium micrum）粗提物的细胞毒活性,筛选其KS基因。方法：非无菌条件培养微小卡罗藻,用乙酸乙酯提取其粗产物,以脐静脉内皮细胞（HUVEC）为目标细胞,测定粗提取物的细胞毒活性;运用分子生物学方法对多聚酮合酶（PKS）基因的酮基合成酶（KS）基因进行筛选,运用BLAST进行比对和系统发生树进行分析。结果：微小卡罗藻培养液粗产物具有细胞毒活性,IC50值为70．8μg／mL。KS基因筛选获得680bp的片段,并经测序推导出其氨基酸序列,该氨基酸序列与纤维多囊菌和点型念珠蓝细菌KS域的氨基酸序列同源性分别为60％和57％。结论：首次从非无菌培养的微小卡罗藻中筛选到PKS中KS域基因片段,为从中分离聚酮类化合物提供了基因学的依据。     

一株甲烷利用菌的分离、鉴定和性能研究

目的：研究土壤中能利用甲烷的细菌类型及特性。方法：运用传统的富集、分离、纯化方法得到1株甲烷利用菌,结果：该菌株在显微镜下呈球形,在液体培养基中生长72h后OD值可达到0.8左右,其最适生长温度30℃,最佳pH值7左右。对该菌株进行了16SrDNA扩增,测序结果表明其与Pseudoxanthomonas菌属的序列相似性为93%,其生理生化特征和分子鉴定结果表明,该菌与假黄单胞菌为不同的属。甲烷消耗气相色谱分析结论显示,120h后培养瓶中的甲烷浓度降低60%左右,说明该菌株具有较好的利用甲烷的性能。     

大庆湿地可培养噬藻体的分离及其相关基因的系统进化分析

【目的】揭示大庆湿地可培养蓝藻噬菌体遗传基因多样性,分析其系统进化地位,为噬藻体生态学研究提供数据支持。【方法】以鱼腥藻(Anabaena PCC7120)为宿主,采用液体富集和双层平板法分离大庆湿地水体中可培养的噬藻体,提取噬藻体混合液的DNA,PCR扩增噬藻体编码衣壳组装蛋白的g20基因和编码T7型短尾病毒的核糖体聚合酶的pol基因,克隆测序,构建系统进化树,明确可培养噬藻体相关基因的系统进化地位。【结果】克隆测序获得1条g20基因序列,4条pol基因序列。系统进化分析表明,获得g20序列隶属于可培养噬藻体类群(Clusterδ)中。而3条pol基因与我国吉林碱性稻田水体噬藻体类群(PG-Pol-I和PG-Pol-II)更相近,另一条pol序列形成独立的进化分枝。【结论】这是首次调查大庆湿地水体侵染鱼腥藻的可培养噬藻体的g20和pol基因,初步确认以鱼腥藻(Anabaena PCC7120)为宿主的可培养噬藻体g20基因归属于Clusterδ中,而大庆湿地可培养噬藻体的pol基因与我国大安稻田水体pol基因相近。     

一株基因克隆干扰菌的鉴定及其发酵液降解DNA活性分析

旨在寻找导致基因克隆失败的原因,检测整个电泳环境中是否存在对DNA有强降解力的菌株。依据菌体形态,革兰氏反应以及16S rDNA序列对DNA降解菌株进行鉴定,琼脂糖凝胶电泳分析菌株对DNA的降解活性。结果显示,从DNA电泳槽中分离到了一株菌,革兰氏染色鉴定为阴性菌,对该菌进行液体培养,利用质粒pUC19作为底物,检测该菌发酵液对DNA的降解能力,发现该菌发酵液能够迅速并彻底地降解DNA,其最佳降解温度为45℃,将该菌命名为DD(DNA degrading)。对该菌的16S rDNA进行测序比对后,发现其与粘质沙雷氏菌(Serrtia marcescens)的16S rDNA序列同源性高达100%。结合菌体形态,革兰氏反应以及16S rDNA序列结果,DD菌株为一株粘质沙雷氏菌,DNA降解活性分析显示其具有很强的DNA降解能力。     

集胞藻PCC6803高效基因表达平台的构建与评价

针对蓝细菌代谢工程改造的需求,成功构建了可以在模式蓝细菌菌株集胞藻PCC6803中高效表达外源基因的3个基因组整合表达平台,以及1个可以在多株蓝细菌中表达的广宿主穿梭表达平台。该表达平台通过选用集胞藻PCC6803中1,5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶的启动子驱动外源基因的表达,应用“SD-AUG”翻译融合的策略提高外源蛋白翻译效率,以及加入终止子序列Trbc以提高转录终止效率,实现了对外源基因的高效表达。利用lacZ作为报告基因,检测了所构建表达平台pFQ20在集胞藻中的基因表达效率,结果显示β-半乳糖苷酶的活性为109 Miller。同时,基于pFQ20表达平台在集胞藻PCC6803中表达了来自大肠杆菌的硫酯酶基因tesA’,蛋白印迹实验结果显示了硫酯酶的成功表达。该表达平台为在蓝细菌中开展遗传研究及基因工程改造提供了有用的遗传工具,其构建策略为在蓝细菌中构建高效稳定的外源基因表达元件提供了借鉴。     

一株微囊藻毒素降解菌的筛选及鉴定

从蓝藻爆发期间的巢湖底泥中筛选微囊藻毒素降解菌,为水体中藻毒素-LR(MC-LR)污染的生物治理提供有效的菌源。以MC-LR为唯一碳氮源,利用富集驯化培养技术分离筛选MC-LR降解菌,并对其进行形态观察、生理生化实验及16S rRNA序列分析鉴定。从巢湖底泥中分离得到一株藻毒素-LR降解菌株M6,生理生化实验及分子鉴定结果均表明,该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。分离出的MC-LR降解菌为蜡状芽孢杆菌,该菌株对MC-LR有较高的降解能力。     

杜氏盐藻泛素基因cDNA的克隆及系统进化分析

根据玉米,水稻等物种泛素序列设计一对简并引物.提取杜氏盐藻细胞的总RNA,利用RT-PCR方法扩增盐藻泛素基因的cDNA片断,回收两个长度不同的片断ubi-1和ubi-2,将其克隆到pMDl8-T载体上,测序后进行序列分析,为克隆杜氏盐藻泛素基因的cDNA序列并进行进化分析.结果 ubi-1经测序后得到一个完整拷贝(228 bp)和一个不完整的泛素cDNA序列(191 bp).Ubi-2经测序后得到两个拷贝(556 bp)和一个不完整的泛素cDNA序列(191 bp).盐藻3个不同拷贝泛素cDNA序列之间存在差异,但所编码氨基酸序列相同.盐藻泛素cDNA序列与其他物种的泛素cDNA序列具有高的同源(70%～85%),所推导的氨基酸序列与其他物种仅存在1～2个氨基酸的差异.进化分析显示,所分离的盐藻泛素基因与两个模式生物果蝇和衣藻的泛素基因共处一个进化支,彼此亲缘关系最近.盐藻泛素基因与其他物种的泛素基因可能来自共同的"祖先"基因.在进化中高度保守.     

醋酸钙不动杆菌的分离鉴定及溶藻特性

淡水微囊藻水华不仅造成水体动植物缺氧死亡,而且释放藻毒素,影响人类和其它动物的健康。利用液体感染技术,从河南省平顶山市白龟山水库分离一株能够溶解铜绿微囊藻PCC 7806的溶藻菌,命名为溶藻菌5,16S r DNA核苷酸序列测序证实该菌株为醋酸钙不动杆菌。它具有一定的溶藻特异性,只溶解PCC 7806,对FACHB-930和斜生栅藻没有影响,能够促进衣藻和红球藻的生长。最佳溶藻体积比为1∶1。溶藻菌5的菌体和无细胞培养物均具有相同的溶藻效果。显微观察藻细胞被溶解的黄化液显示细菌并未附着在藻细胞周围,也无菌胶膜形成。表明溶藻菌5可能通过释放杀藻物质和与藻竞争营养物质两种机制溶解藻细胞。     

杜氏盐藻RuBisCO小亚基基因的克隆和分析

根据莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、团藻(Volvox carteri)、伞藻(Acetabularia cliftonii)等生物的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的小亚基rbcS基因氨基酸的高度保守序列,设计一对简并引物,进行RT-PCR.209 bp的PCR产物经测序分析及进行氨基酸序列同源性比对,表明克隆的序列为盐藻rbcS基因的cDNA片段.根据该序列信息,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends) 方法扩增其5'上游未知区和3'下游未知区.5'RACE得到的cDNA长度为约300 bp,3'RACE得到的长度约380 bp.三段序列拼接后cDNA全长为878bp,其中开放读码框包括190个氨基酸.此cDNA序列,推导成氨基酸序列与已知物种的rbcS基因相比对,同源性分别为V.carteri 78%,C.reinhardtii 75%,A.cliftonii 67%,据此可推断所克隆的序列为盐藻RuBisCO的小亚基cDNA序列,GenBank收录号为AY739272.     

腾格里沙漠东南缘可培养微生物群落数量与结构特征

以腾格里沙漠东南缘沙漠化土壤为研究对象,研究了不同沙漠化修复程度土壤结皮及结皮下微生物分布特征及多样性。结果表明:研究区域可培养细菌数量随沙漠化生态修复进程呈升高趋势,随采样深度呈下降趋势。数量以节杆菌属和芽孢杆菌属为主,其含量随沙漠化修复程度分别呈降低与升高趋势。修复过程中可培养土壤微生物数量与土壤碳、氮含量呈极显著正相关关系,与pH值呈极显著负相关关系,说明微生物数量与沙漠化土壤改良程度密切相关。通过16S rDNA基因测序及构建系统发育树,研究区域可培养细菌归类为18个属,分属于6个系统发育组:高G+C革兰氏阳性类群、低G+C革兰氏阳性类群、α-变形菌、β-变形菌、γ-变形菌和CFB类群,序列比对显示菌株功能多样。     

东北旱田土壤中Anabaena伴生细菌的分离与鉴定

[背景]鱼腥藻(Anabaena)在农田土壤中广泛分布,具有固碳和固氮功能。明确伴生细菌与蓝细菌的关系,对提高农田土壤中Anabaena的功能具有重要意义。[目的]从东北不同旱田土壤中分离Anabaena sp.PCC7120的伴生细菌,初步鉴定伴生细菌的分类归属,推测伴生细菌的功能,为明确旱田土壤蓝细菌与伴生细菌的关系提供数据支撑。[方法]采用平板分离、PCR-DGGE、克隆测序技术测定并分析不同旱田土壤中伴生细菌的16S rRNA基因序列,确定伴生细菌的分类地位。[结果]PCR-DGGE图谱显示东北旱田14个土样中分离获得Anabaena sp.PCC7120伴生细菌数量和种类不同;PCR-克隆测序获得伴生细菌的16S rRNA基因序列37条,可鉴定到种水平的菌株36条,主要归为鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、贪噬菌属(Variovorax)、黄杆菌属(Flavobacterium)和红球菌属(Rhodococcus)等,推测这些伴生细菌具有适应寡营养、富集微量元素、清除毒素等功效。[结论]东北旱田不同土壤中Anabaena sp.PCC7120伴生细菌种类和数量各异,这些伴生细菌主要隶属于Sphingopyxis、Variovorax、Flavobacterium和Rhodococcus等属。     

3种水稻土中7株固氮蓝细菌的分离与特征

【背景】蓝细菌是水生和陆地生态系统中生物固氮的主要贡献者。【目的】增加对稻田土壤固氮蓝细菌的了解,获得用于进一步研究的可培养固氮蓝细菌菌株。【方法】选择3种具有不同固氮能力的水稻土,采用BG11-N培养基分离培养固氮蓝细菌菌株,对新分离菌株进行形态特征观察,通过基因组DNA的nifH基因扩增明确其固氮潜力,进一步采用乙炔还原法和~(15)N_2示踪法定量测定其固氮能力,通过基因组DNA的16SrRNA基因序列比对进行鉴定。【结果】在光照培养条件下,采用BG11-N培养基共分离纯化得到自养菌株7株,细胞呈圆形或椭圆形、单列、无分枝、丝状和念珠状,在固体培养基上形成团垫状菌落。新分离菌株在BG11-N培养基中生长状况良好,以基因组DNA为模板可扩增出nifH基因,乙炔还原法和~(15)N_2示踪法测定结果显示具有较高固氮能力,同时具有铁载体生成能力。结合16S rRNA基因序列比对和形态特征,7株菌被初步鉴定隶属于念珠藻科(Nostocaceae)。【结论】从水稻土中分离到在稻田生物固氮中发挥重要作用的蓝细菌(念珠藻科)菌株,可培养固氮蓝细菌菌株固氮能力较高,兼具铁载体生成能力,可作为进一步深入研究的微生物资源,具有潜在的研究应用价值。     

前沟藻18S rDNA序列克隆和分子鉴定分析

旨在扩增一株未知微藻18S rDNA,并进行序列分析和物种鉴定分析.提取该微藻总DNA,用PCR技术扩增其18S rDNA,对序列进行测序,在GenBank进行序列比对分析,用ClustalX软件构建进化树;用光学显微镜进行形态学分析.经测序其序列长度为1 736 bp,G+C为47％;同源性分析表明,与GenBank中多个强壮前沟藻种的18S rDNA基因序列同源性迭99％;与前沟藻属的其它藻种同源性均迭95％以上.而与裸甲藻属和环藻属的藻株同源性为85％左右.经光学显微镜观察,该藻具有典型的强壮前沟藻形态.结合该藻18S rDNA序列分析和粗略的形态学分析,推断该藻可能为前沟藻属的强壮前沟藻.微藻形体微小,结构简单,需借助电子显微镜才可准确地从形态学上签定其种属,鉴定工作繁琐费时;而利用分子技术,则可能使鉴定工作变得简单快捷.     

根际细菌在长刺蒺藜草氮素利用中的作用

【目的】入侵植物长刺蒺藜草在贫瘠土壤中能够快速生长和扩张,形成单一优势群落。本研究分析长刺蒺藜草入侵对土壤氮循环及相关微生物群落的影响,以期为揭示其入侵的微生态学机理提供理论依据。【方法】利用16S rRNA和nifH基因扩增子高通量测序技术分析长刺蒺藜草、披碱草、冰草、狗尾草根际土壤细菌及固氮菌群落结构和功能的差异。【结果】长刺蒺藜草入侵显著增加了土壤全氮和硝态氮含量,显著降低了水溶性氮和铵态氮的含量。根际土壤高通量分析结果表明:芽孢杆菌、蓝细菌、念珠藻、鱼腥藻、厚壁菌门在长刺蒺藜草固氮菌群落中有明显富集;长刺蒺藜草可能通过增加变形菌门的相对丰度,降低蓝细菌和厚壁菌门的相对丰度来提高其固氮能力,促进对氮素的吸收利用;硝化螺旋菌属和阿菲波菌属在长刺蒺藜草对氮素的利用过程中影响较小。【结论】长刺蒺藜草通过改变入侵地根际土壤细菌和固氮菌的群落结构,影响根际土壤的氮素环境,以利于自身生长。     

丝状蓝藻长孢藻属的中国一新记录种——蒙氏长孢藻

近期在湖北省陆水水库进行野外调查时发现了在中国尚未报道的蒙氏长孢藻Dolichospermum mendotae（Trelease）Wacklin,et al.2009。文章详尽地描述了该种的特征,并对其16S rRNA基因测序分析表明,与日本、西班牙、捷克等地区所得到的该种的序列相似度很高,显示出来自不同地区的蒙氏长孢藻在分子系统进化树上聚为一支。最后通过毒素分子检测和生物试验显示分离于陆水水库的三株蒙氏长孢藻不产神经毒素。     

两株采自惠州的细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae)嗜热蓝细菌的分离鉴定及细胞组分分析

【背景】随着CO_2排放增加,全球变暖愈发严峻,嗜热蓝细菌作为能够在45°C及以上环境中生长并实现生物固碳的微生物,具有重要的研究意义。【目的】对从广东惠州地区采集的藻种进行分离鉴定,并筛选出2株嗜热蓝细菌,研究其生长特性,为嗜热蓝细菌的后续应用提供依据。【方法】通过16SrRNA基因、藻蓝蛋白链A基因(PhycoA)序列分析确定从惠州地区采集到的菌株的分类学位置。对PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29两株嗜热蓝细菌进行形态观察和主要细胞成分(灰分、糖类、脂质、蛋白质和色素)分析。【结果】共分离出12株嗜热蓝细菌,其中PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29菌株,形态上呈蓝绿色球形毛状体,是由细胞形成密集的簇,彼此附着形成的。两株嗜热蓝细菌的主要细胞成分是糖类,分别占细胞干重的36.42%和28.46%。PKUAC-GDTS1-24的灰分、脂质和蛋白质含量分别为24.41%、21.40%和26.64%。PKUAC-GDTS1-29的细胞中,灰分、脂质和蛋白质含量分别为24.72%、23.92%和12.93%。藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)在PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29中的含量分别为157.29 mg/g DW和374.86 mg/g DW,类胡萝卜素分别为65.13 mg/g DW和18.87 mg/g DW。【结论】基于系统发育树研究,本实验的2个分离株属于细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae),与研究较少的纤发鞘丝蓝细菌属(Leptolyngbya)菌株相近,可能是广东和四川温泉中存在的一种新型丝状轻度嗜热蓝细菌属或Leptolyngbya新种。嗜热菌株PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29的形态和细胞组成相似,通过比较,2个菌株的藻胆蛋白含量远远高于其他研究报道的Leptolyngbya蓝细菌,尤其是PKUAC-GDTS1-29可以作为藻蓝蛋白生产的潜在菌株。     

腾冲热海眼镜泉粉红色菌藻席的细菌组成分析

应用免培养法系统研究眼镜泉粉红色菌藻席的细菌组成。经过克隆筛选,测定了23个克隆的16S rDNA插入片段的近全序列。与GenBank的序列进行比对和相似性分析,结果表明,组成该菌藻席的细菌分属于Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacter、Deinococcus-thermus、Aquificals 6个类群(phylum),表现出了高度的细菌多样性。结合分析温度相近的5个热泉：Octopus spring、Haegindi and Fluidir spring、Olkelduhals、Grendalur spring中的菌藻席细菌组成,表明生态位相近的不同环境中,其物种组成相近。Aquificales是中性或弱碱性高温热泉菌藻席群落的优势物种。     

盐藻PSY基因cDNA的克隆、序列测定及其进化分析

以盐藻总RNA为模板,根据已获得的盐藻PSY基因起始和终止密码子附近的核苷酸序列设计引物,通过RT—PCR扩增获得盐藻PSY cDNA片段．盐藻PSY基因cDNA全长1260bp,编码的盐藻PSY蛋白由420个氨基酸组成,大小为47．3kD,等电点为8.67．在GenBank中进行Blast P检索,发现该片段与许多植物PSY具有较高的相似性(78％～89％)．系统进化分析进一步证明,藻类PSY与蓝细菌PSY亲缘关系最近．     

高产β-葡萄糖苷酶N1菌株的分类鉴定

从纳豆中分离纯化得到1株β-葡萄糖苷酶高产菌株,命名为N1菌,利用16S rDNA分析对该菌作了系统进化鉴定.首先提取N1菌基因组DNA,根据不同种属细菌的16S rDNA序列两端的保守性设计通用引物,对N1菌16S rDNA片断进行PCR扩增,对扩增得到的目标片段测序,利用BLAST对测序结果进行比对,构建系统进化树进行分析,初步确定该菌属于枯草芽孢杆菌.研究表明以16S rDNA分析对该菌鉴定完全可行.