结核分枝杆菌HspX蛋白的原核高效可溶性表达及产物抗原性分析

目的:利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌HspX蛋白并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增HspX核酸序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western印迹初步评价HspX的抗原性。结果:经IPTG诱导,HspX蛋白在原核系统内获得了可溶性表达,经镍柱亲和层析获得了纯度达95%以上的重组蛋白。Western印迹结果证明重组HspX蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论:重组蛋白HspX在大肠杆菌中以可溶性形式表达,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。     

结核分枝杆菌Rv3425蛋白的原核表达纯化及其血清学诊断价值

目的：用原核系统表达结核分枝杆菌Rv3425蛋白并纯化,评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法：以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板,PCR扩增得到Rv3425基因序列,克隆至表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达后纯化,用Western印迹和ELISA法进行抗原性初步评价。结果：在原核系统内经IPTG诱导表达后,Rv3425蛋白主要以包涵体形式存在,经复性和镍柱层析纯化后,纯度达95%以上;Western印迹和ELISA结果证明重组Rv3425具有较强的抗原活性;用纯化的Rv3425蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达50%。结论：高纯度的Rv3425蛋白在结核病诊断方面具有很高的应用价值,可作为结核病诊断的备选抗原。     

结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测

目的:克隆38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性。方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBVIL1表达载体,在大肠杆菌HB101株中进行表达,以间接ELISA方法初步评价其抗原性。结果:获得了结核分枝杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所纯化获得的抗原具有良好的抗原性。结论:pBVIL1表达载体可以高效表达多种结核分枝杆菌抗原,38kD、ESAT-6和CFP10抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原。     

结核分枝杆菌Rv3881c突变子的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：融合表达结核分枝杆菌Rv3881c突变子抗原,以便与其他已知的免疫显性抗原联合使用,有效增加结核分枝杆菌感染血清学检验的敏感性和特异性。方法：将克隆的来源干结核分枝杆菌H37Rv株的Rv3881c突变体基因插入原核表达载体pET24b,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达;由于重组的Rv3881c突变子抗原片段同C端的6xHis标签融合表达,使用Ni-柱进行快速纯化。结果：Western印迹表明,重组的Rv3881c突变子抗原同选取的6例结核病阳性临床血清标本均能发生明显的反应。结论：重组Rv3881c突变体具有较好的特异性,提示该抗原可能成为检测结核的有效抗原之一。     

ESAT6-CFP10融合蛋白基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-T-easy载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的重组载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pDE22分泌表达穿梭载体,以电穿孔方法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌。PCR筛选到的阳性克隆经温度诱导后,SDS-PAGE和Western印迹检测表达蛋白的正确性。结果:可表达出相对分子质量约23000的ESAT6-CFP10融合蛋白。Western印迹证明重组蛋白有较好的免疫原性。结论:获得能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,为结核病的预防奠定了一定的基础。     

血清学诊断中结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶的应用

[目的]在原核系统中表达结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate car-boxykinase PEPCK),并研究该蛋白在诊断结核病人血清抗体中的应用价值.[方法]应用基因重组技术表达重组蛋白结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶,经亲和层析法纯化表达产物.用表达的重组蛋白免疫小鼠,研究其免疫学特性.间接酶联免疫吸附试验(Enzyme link immunosorbent assay,ELISA)检测结核病人血清中特异性IgG抗体,并与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒检测结果对比.[结果]试验表明转化入大肠杆菌中的重组质粒能够表达并纯化出相对分子量为72 kDa的重组蛋白;Western blot证实重组蛋白能够与小鼠抗BCG血清发生特异性反应;重组蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中的抗体滴度可达1∶1280以上;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测病人血清阳性率为17.3%(30/173),其中排菌病人的阳性率为32.5%(13/42),不排菌病人的阳性率为12.9%.该方法结果与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒的检测结果相比,敏感性为51.0%,特异性为96.7%.[结论]结核杆菌PEPCK具有较好的免疫原性和抗原性,有可能作为结核病血清学诊断的一组抗原之一.     

结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达

目的:构建含结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体并转染HEK293T细胞,高效表达分泌性38kD蛋白。方法:设计合成的结核分枝杆菌38kD基因被克隆到T载体,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切鉴定正确后,PEI转染法导入293T细胞,换不含血清的DMEM培养基培养3 d后收集细胞及上清,采用Western印迹检测38kD蛋白的表达。结果:酶切结果显示,获得正确的含38kD基因的重组表达载体;Western印迹结果显示表达载体导入293T细胞中后能在细胞及上清中检测到38kD蛋白表达。结论:构建了含重组结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.0-38kD,该载体可在哺乳动物细胞HEK293T中高效分泌性表达38kD蛋白,为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2461c基因的克隆、表达、纯化及其抗原性的初步检测

目的:探索结核分枝杆菌Rv2461c基因编码的elpP蛋白作为结核检测抗原的可行性.方法:克隆结核分枝杆菌clpP蛋白的编码基因Rv2461e,构建pET30a-Rv2461c重组质粒,并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆栽体中,测序鉴定结果正确.将pET30a-Rv2461c重组质粒转化到大肠杆茵BL21中,表达纯化目的蛋白进行质谱分析.制备clpP蛋白的多克隆抗体,通过亚细胞分离及Western检测分析蛋白的亚细胞定位,纯化的clpP蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测.结果:结核分枝杆茵clpP蛋白大量存在于细胞质中,少量存在于细胞壁和细胞膜中.重组抗原在检测肺结核病人中的检出率为38.3%(23/60),检测敏感性为38-3%,特异性为90%.结论:为后续深入研究clpP蛋白的生物功能、clpP作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础.     

结核分枝杆菌19kD-ESAT6融合蛋白的克隆表达及纯化

运用聚合酶链反应( PCR) 技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv 中扩增获得19kD 脂蛋白和esat-6 基因片段, 将目的片段分别克隆到pMD18-T 载体, 再亚克隆目的片段到同一表达载体pET-21a, 构建重组表达载体pET21a-19kD-ESAT6, 转化至大肠埃希菌BL21( DE3) , 表达纯化后用蛋白质印迹法( Western blot) 分析其抗原反应性。结果成功构建了重组质粒pET21a-19kD-ESAT6, 并在大肠埃希菌中获得高效表达。SDS-PAGE 结果显示, 在相对分子质量( Mr) 约29 ×103 处有表达条带。estern blot 结果表明, 重组蛋白19kD-ESAT6 与确诊的结核病患者血清发生特异性免疫反应, 具有特异的抗原性。本研究构建的结核分枝杆菌19kD-ESAT6 融合蛋白为结核病血清学诊断试剂的开发提供了依据。     

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

[目的]研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法.[方法]采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与Pmd18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒.然后定向插入到Pet-32a( )表达载体,筛选原核表达载体Pet-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床.[结果]DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达.Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5 ug/孔,血清最佳稀释度为1:100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性.通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测.[结论]以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测.     

结核分枝杆菌Rv3425特异性蛋白片段与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用价值

目的:对结核分枝杆菌Rv3425蛋白进行生物信息学分析及抗原表位预测,评价Rv342519-176重组蛋白与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用。方法:PCR扩增结核杆菌Rv3425蛋白19～176位的编码基因片段,原核表达并纯化Rv342519-176重组蛋白(rRv342519-176)和CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6),建立以重组蛋白为抗原的ELISA方法,评价2种蛋白在结核抗体检测中的联合应用价值。结果:具有抗原表位的rRv342519-176与rCFP10-ESAT6在大肠杆菌中高效表达;ELISA结果显示,rRv342519-176的敏感性为39%,特异性为97.5%;rCFP10-ESAT6的敏感性为37%,特异性为95%;2种蛋白联合检测,敏感性提高到57%,特异性为95%。结论:生物信息学预测Rv3425的优势抗原表位,表达并纯化的rRv342519-176和rCFP10-ESAT6在结核抗体检测中具有一定的抗原互补性,在保持特异性的基础上可显著提高检测敏感性。     

结核分枝杆菌重组38kD蛋白用于新疆南疆维吾尔族和湖南湘中汉族血清学诊断的研究

目的：对结核分枝杆菌38kD蛋白编码基因进行克隆表达及纯化,建立基于重组38kD蛋白的酶联免疫吸附法（EusA）检测结核病人血清标本,评价重组38kD蛋白用于结核病血清学诊断抗原的价值。并比较分析其在汉族和维吾尔族人群中的血清学诊断的差异。方法：用PCR方法扩增38kD蛋白的编码基因,构建重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,得到纯化的38kD蛋白,建立以38kD蛋白为包被抗原的ELISA,并检测临床确诊的结核病人血清标本。结果：ELISA检测结核病患者血清标本的维吾尔族阳性率为34％（52／153）,汉族为52．4％（65／124）,两者对比有统计学差异（x2=9．538,P〈O．005）。在阴性对照中的维吾尔族特异度为96．4％（159／165）,汉族为98．8％（130／133）,结果无统计学意义（x2=0．111,P〉0．5）。结论：重组38kD蛋白用于血清学诊断的敏感度在维吾尔族和汉族中有差异,而其诊断特异度无差别。     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

小鼠附睾分泌的防御素Defb48的原核表达及纯化

目的:获取小鼠附睾分泌的防御素Defb48的基因并原核表达、纯化,为研究其功能奠定基础。方法:提取小鼠附睾组织的总RNA,用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的Defb48编码序列,将2段Defb48编码序列串联克隆至原核表达载体pET28(a)中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白;用镍柱进行重组蛋白的纯化,然后进行SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:获得实验所需小鼠附睾分泌的防御素Defb48的基因序列,测序结果与已发表的基因序列一致;在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达了His-Defb48融合蛋白,经Western印迹分析,在相对分子质量18 000处有特异的蛋白条带,镍柱纯化后获得纯度较好的融合蛋白。结论:克隆了小鼠附睾分泌的防御素Defb48基因,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达纯化出融合蛋白,为制备其多克隆抗体,进而进一步研究Defb48的功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3871抗原优势肽段的克隆表达及抗原性鉴定

目的:为了提高结核病诊断试剂的特异性和敏感性,克隆表达结核分枝杆菌H37Rv株RD1区Rv3871抗原优势肽段,并应用ELISA法对其抗原性进行初步鉴定。方法:利用Biosun生物信息学软件对Rv3871抗原进行表位分析,通过PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv3871抗原优势肽段编码基因,在大肠杆菌HB101中进行表达,采用间接ELISA法初步评价其抗原性。结果:Rv3871-1肽段检测的敏感性为32.5%(13/40),特异性为97.2%(35/36);Rv3871-2敏感性为45%(18/40),特异性为100%;Rv3871-3敏感性为37.5%(15/40),特异性为91.6%。结论:结核分枝杆菌RD1区Rv3871抗原优势肽段Rv3871-2有较高的特异性和敏感性,有望作为候选抗原用于结核病患者的血清学检测。     

大鼠热休克蛋白70的融合表达及纯化鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化大鼠热休克蛋白（HSP）70与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白,以进一步研究细胞外HSfr70的生物学功能。方法：用RT-PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体转化大肠杆菌B121,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,建立最佳诱导表达条件;采用Amylose树脂预装柱对目的蛋白进行亲和纯化,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果：克隆出目的基因,构建了融合表达载体pMAL-c2X／hsp70;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带,并纯化出纯度较高的融合蛋白;免疫印迹鉴定表明其具有抗原活性。结论：在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白MBP-HSP70,为进一步研究细胞外HSP70的生物学效应提供了有用的材料。     

小鼠β-防御素30的原核表达和纯化

目的:在原核细胞中表达小鼠β-防御素30(DEFB30),并对表达产物进行鉴定和纯化。方法:用RT-PCR方法扩增小鼠Defb30的cDNA序列,将2个拷贝的cDNA序列串联连入原核表达载体pET28(a),构建重组表达载体pET28(a)-Defb30,并将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,以Western印迹分析表达产物His-DEFB30,用Ni-NTA亲和柱纯化融合蛋白。结果:构建了Defb30基因的原核表达载体,经IPTG诱导,相对分子质量约15×103的融合蛋白获得表达,Western印迹分析证实此蛋白即为目的蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化,获得了高纯度的融合蛋白His-DEFB30。结论:获得了在大肠杆菌中表达的DEFB30,为研究该蛋白的免疫避孕效果、抗菌活性奠定了基础。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

重组黄热病毒E蛋白结构域Ⅲ作为亚单位疫苗的抗原性和免疫原性

目的：表达纯化黄热病毒（YFV）囊膜蛋白（E蛋白）结构域Ⅲ,研究其作为亚单位疫苗预防YFV、日本脑炎病毒（JEV）感染的可能。方法：扩增YFVE蛋白结构域Ⅲ（YFDⅢ）的cDNA片段333bp,将其连接到原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达载体pET-YFDⅢ,转化感受态大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导表达重组YFDⅢ;用纯化的YFDⅢ免疫新西兰兔和BALB/c鼠,检测相关抗体滴度。结果：在大肠杆菌中可溶性表达了YFDⅢ融合蛋白,表达量约占菌体蛋白的50%;Western印迹及ELISA分析表明,纯化的YFDⅢ具有良好的抗原性和免疫原性;利用纯化的YFDⅢ免疫新西兰兔,获得了高达1∶4×105滴度的抗YFV抗体和1∶2×104滴度的抗JEV抗体;利用纯化的YFDⅢ免疫BALB/c鼠,获得了1∶7×104滴度的抗YFV抗体和1∶2×103滴度的抗JEV抗体。结论：重组YFDⅢ有较好的免疫原性,具有开发成亚单位疫苗的潜能。