肾综合征出血热病毒糖蛋白的提纯和鉴定

以感染肾综合征出血热病毒(HFRSV)的Vero E6细胞为材料,用免疫亲和层析结合制备聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)从感染细胞中提纯了HFRSV两种糖蛋白。先用免疫亲和层析从感染细胞的粗制抗原中获得含有四种蛋白的混合液,用[~3H]-氨基葡萄糖在感染细胞中标记病毒糖蛋白,观察到[~3H]-氨基葡萄糖只结合入78K和57K的病毒蛋白。再用制备SDS-PAGE从HFRSV混合液中提纯78K和57K两种蛋白。实验证明这两种糖蛋白均具中和抗原决定簇,57K的糖蛋白尚具血凝活性,初步鉴定表明这两种糖蛋白相当于文献报道的HFRSV G_1和G_2。     

应用病毒感染细胞酶联免疫吸附试验检测肾综合征出血热病毒抗原和抗体

应用病毒感染细胞酶联免疫吸附试验(VIC-ELISA)检测肾综合征出血热病毒(HFRSV)感染性滴度比双抗体间接ELISA和间接免疫荧光法(IFA)分别敏感10倍和100倍。VIC-ELISA检测兔抗HFRSV抗体的滴度比双抗体间接夹心ELISA和IFA分别敏感1.6倍和8倍。VIC-ELISA能敏感、快速、有效地检测HFRSV抗原和抗体。     

肾综合征出血热病毒在恙螨体内增殖的动态观察

取饲养的小盾纤恙螨幼虫和若虫．每20d为一批制成无菌滤液接种Vero-E6细胞测定HFRSV滴度,动态观察HFRSV在螨体内的增殖情况,并用PCR技术检测恙螨幼虫和若虫体内HFRSV－RNA。结果如下：小盾纤恙螨幼虫期除60d一批外,其余各批均在不同时间内测出HFRSV滴度,3批若虫中亦有2批测出HFRSV滴度并检测到HFRSV－RNA。结果为小盾纤恙螨作为HFRS的传播媒介提供了进一步的证据。     

肾病综合征出血热病毒(HFRSV)的细胞内放射性标记

Lee于1978年在南朝鲜分离到肾病综合征出血热病毒——Hantaan病毒后,我国病毒学者对HFRSV的分离、流行病学、血清学以及病毒形态学做了大量工作。近几年来国外用Hantaan病毒研究生化特征。研究病毒生化需要纯的病毒,针对HFRSV在细胞内复制周期较长,病毒产量低,我们用~3H—氨基酸对HFRSV进行细胞内标记,初步探索感染对细胞蛋白质合成的影响、标记的适当条件和标记HFRSV在病毒蛋白研究上的应用,现将结果报告如下:     

肾综合征出血热病毒基因的检测、分型和衣壳蛋白基因的克隆及表达

根据我国流行的2型肾综合征出血热病毒(HFRSV)代表毒株汉滩型(HTNV)76-118株和汉城型(SEOV)R_(22)株M节段的核苷酸序列,设计2型共同引物,建立了逆转录-聚合酶链反     

应用APAAP光镜技术发现两株HFRSV敏感细胞中HFRSV包涵体

本文应用抗HFRSV McAb的APAAP(碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶)免疫组化技术,首次用光镜在HFRSV感染8—14天的Hep-2和wish细胞中查出病毒包涵体,并且根据其位置和形态特征可分为:(1)中央型包涵体;(2)外周型包涵体;(3)脱落包涵体。上述所见包涵体均在电镜下得到证实。此结果对于了解HFRSV感染细胞后的致病变作用以及研究HFRSV感染细胞包涵体的特征、来源、性质和形成过程具有十分重要的意义。     

肾综合征出血热病毒T-E抗原的制备及其特性研究

本试验建立了用Tween 80和乙醚处理HFRSV感染鼠脑、肺制备特异性抗原的方法,该抗原具有安全、稳定、特异性好、制备简单的特点,可能是HFRSV抗原的共同组分。     

靶向探针追踪Aβ_(25-35)的亚细胞定位并基于Nrf2通路探讨阿里红多糖对线粒体损伤的保护机制

用靶向探针追踪淀粉样蛋白(Aβ_(25-35))的亚细胞定位情况,同时基于Nrf2信号通路探讨阿里红多糖组分(FOAPs-a)和(FOAPs-b)对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞线粒体损伤通路的保护作用机制。采用40μmol/L Aβ_(25-35)诱导PC12细胞建立阿尔茨海默病(AD)细胞模型,将PC12细胞分为空白组、模型组(加40μmol/L Aβ_(25-35))、阳性组(加50μmol/L盐酸多奈哌齐)、不同浓度的FOAPs-a和FOAPs-b干预组(各50、100、200μg/mL)。以靶向探针追踪Aβ_(25-35)在各组PC12细胞中的亚细胞定位情况;通过试剂盒检测PC12细胞中活性氧自由基ROS的变化情况;Western blotting法测定细胞凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达量以及和Nrf2通路相关的Nrf2、APK1和磷酸化的APK1蛋白的表达情况。结果发现,Aβ_(25-35)处理PC12细胞会影响线粒体的完整性;在200μg/mL FOAPs-a/b预处理PC12细胞后,能够显著缓解Aβ_(25-35)对线粒体的损伤,同时使Aβ_(25-35)的亚细胞共定位减弱;与空白组比较,模型组细胞中ROS含量增加,与模型组比较,FOAPs-a及FOAPs-b干预组均能降低ROS的沉积,差异有统计学意义;Western blotting结果显示:与模型组比较FOAPs-a及FOAPs-b均能减少APK1的磷酸化水平,上调Nrf2的蛋白表达水平。总之Aβ_(25-35)可进入到PC12细胞的线粒体中引起其损伤,阿里红多糖组分能够通过激活Nrf2信号通路显著缓解Aβ_(25-35)对PC12细胞线粒体的损伤。     

肾综合征出血热病毒对不同生理状态小鼠的实验感染及在小鼠淋巴细胞亚群中的定位

本文用双标记免疫细胞化学和双标记免疫电镜技术观察了环磷酰胺处理的BALB/c小鼠及乳鼠实验感染肾综合征出血热病毒后的发病和病毒定位情况,结果发现,免疫功能不成熟或有缺陷的小鼠感染后发病并有规律地死亡,而免疫功能正常鼠只呈隐性感染。在发病的和隐性感染的小鼠之间,病毒定位主要差别在于HFRSV是否感染免疫器官,即HFRSV抗原可见于发病鼠外周血,牌和胸腺的单个核细胞中,而在隐性感染小鼠的这些免疫器官中则为阴性,HFRS病毒颗粒及病毒抗原广泛见于发病鼠的T细胞亚群中,在Thy-1,L3T4和Lyt-2亚群中,双标记阳性细胞百分比分别为24.6+—15.3％,7.5％+—6.1％和17.7+—6.1％。对HFRSV在T细胞中分布的差异还作了动态比较。结果提示:细胞免疫可受HFRSV的直接影响,病毒对宿主免疫系统的感染是HFRSV感染发病的一个关键因素。     

肾综合征出血热病毒血凝素的研究 Ⅱ.血凝和血凝抑制试验影响因素的探讨

本文探讨了肾综合征出血热病毒(HFRSV)血凝和血凝抑制(简称血抑)试验的主要影响因素,观察到HFRSV血凝素的制备要求较高,4℃保存的效果较好,血凝素对热似有一定的稳定性,血凝作用的条件较为严格,最佳pH在5.7—6.1,鹅血球较为敏感,氯仿法去除血清中非特异性抑制物有效而简便。通过试验条件的模索和方法的改进,使之适用于基层。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

用Epstein-Barr病毒转化法获得分泌肾综合征出血热病毒抗体的B淋巴细胞系

人B淋巴细胞膜上带有Epstein-Barr(EB)病毒受体,用EB病毒转化人B淋巴细胞是获得人源性单克隆抗体的重要方法之一。最近David等报道,先用EB病毒转化感染巨细胞病毒(CMV)患者的脾脏B淋巴细胞,再将转化了的B淋巴细胞和人骨髓瘤细胞WL-L_2-727融合,获得迄今为止分泌抗体滴度最高的人—人杂交瘤312A和914,能稳定分泌抗体达12     

应用型特异性单克隆抗体快速鉴定登革病毒

1986年,在海南岛发生登革热爆发流行期间,应用型特异性单克隆抗体以间接免疫荧光法快速鉴定所分离的35株登革热毒。接种标本的第一代C_6/36细胞于感染病毒后96小时内登革病毒抗原检出率可达97％     

禽副粘病毒2型(APMV-2)血凝素单克隆抗体的制备与初步应用

禽副粘病毒2型(Avian paramyxovirus type 2,APMV-2)属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属,是养禽生产中的一种常见病原,禽类感染较为普遍[1,2].利用单克隆抗体对APMV-2进行相关研究也有一些报道,例如Ozdemir等制备了APMV-2的单克隆抗体,并利用单抗对APMV-2的抗原性差异进行了研究[3].国内张国中等也制备了APMCV-2的群特异性单克隆抗体,并利用制备的单克隆抗体建立了检测APMV-2抗原的双抗体夹心ELISA方法用于临床上对该病毒的检测[4,5].     

原位分子杂交法检测恙螨体内肾综合征出血热病毒核酸的研究

为探讨肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）在恙螨体内的分布和定位,采用原位分子杂交技术检测恙螨体内ＨＦＲＳＶＲＮＡ。结果发现：原位分子杂交技术的检出阳性率较ＩＦＡＴ高;ＨＦＲＳＶ阳性信号颗粒呈弥散分布,多见于恙螨幼虫和若虫的腹部组织细胞内,该部位是恙螨的卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞。前体组织细胞内少见;个别幼虫和若虫的前足和中足细胞内亦可见到ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号。在原位分子杂交中,若虫组织细胞内的ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号较幼虫密集而且量多,表明ＨＦＲＳＶ在恙螨体内可传递并有增殖现象     

从我国成人手足口病患者疱液中首次分离出肠道病毒71型

本文报道了从我国手足口病(HFMD)患者疱液中肠道病毒71(E71)型H株的分离和鉴定。该株病毒可在原代人胚肺(HEL)细胞、MA104细胞、BSC细胞中生长繁殖,导致典型的肠道病毒CPE出现。将H株接种乳鼠后出现肢体麻痹、第6天开始死亡。电镜下可见感染H株的BSC细胞胞浆中出现大量的结晶状排列的成熟病毒颗粒,直径约25nm。患者双份血清中有对H株4倍增高的中和抗体存在。采用100抗体单位的抗Cox A5、7、9、16、E70、E71抗体和50抗体单位的LBM组合血清A-H以及抗E71BrCr株MeAb P27对H株进行中和试验时,H株可被抗E71血清和MeAb P27所中和。抗E71抗体对H株的最低有效中和作用为1.6抗体单位,MeAb P27对H株的有效中和作用是64抗体单位。其它血清则无此中和作用。然而,在鉴定过程中发现,高滴度的抗Cox A16抗体(200抗体单位以上)也显出有中和H株的作用,提示我们所分离的H株含有与Cox A16的型间共同抗原。     

PCR和生物素探针对HFRSV的检测和分型的探讨

分析比较肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）７６／１１８株和Ｒ＿（２２）株的核苷酸序列,根据引物设计原则及检测分型的目的,设计并合成了３对引物。１对引物取于两毒株间的高同源区段,作为共同引物和外引物;另两对引物取于两毒株间的低同源区段,分别作为野鼠型引物、家鼠型引物和内引物。建立了ＤＮＡ聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＮｅｓｔＰＣＲ方法,并用ＮｃｓｔＰＣＲ合成了两种型特异的生物素探针。ＰＣＲ检测７６／１１８、Ａ＿９、陈、Ｒ＿２、Ｒ＿２２５个毒株,用外引物时均扩增出１条约３００ｂｐ的条带;用内引物的野鼠型引物时,除Ｒ＿（２２）株之外,其余４株均扩增出１条约７０ｂｐ的条带。斑点杂交试验证实了ＰＣＲ检测分型的准确性。ＮｅｓｔＰＣＲ和生物素探针斑点杂交试验可以测出１－１０ｂｇ的目的ｃＤＮＡ。     

Preparation and Characterization of a Monoclonal Antibody to Prunus necrotic ringspot virus

A cell line named PVRSV1D11 secreting monoclonal antibody (McAb) against the prokaryotically expressed coat protein (CP) of Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) was developed using hybridoma technology including animal immunization, cell fusion, cell line culture and enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA)‐based for screening. The specificity, titre and detection sensitivity of the McAb were determined by indirect ELISA to establish optimal conditions. The antibody reacted strongly with PNRSV and showed no cross‐reactions with the proteins of Plum pox virus, Prunus dwarf virus, Apple stem pitting virus, Apple stem grooving virus, Apple mosaic virus or Apple chlorotic leafspot virus. The ascites developed with PNRSV1D11 cell line showed high absorbance until it was diluted to over 6.6 × 10⁷ fold. The McAb belonged to IgG_2a isotype and was diluted by 1.28 × 10⁵ folds as an optimal detection concentration. The detection sensitivity of the monoclonal antibody was 11.7 ng/ml protein of PNRSV. The results indicated that the McAb against the CP of PNRSV is suitable for PNRSV detection in the plants and for monitoring the dynamics of the virus by using indirect ELISA.