Bax基因诱导鼻咽癌细胞中相关基因的mRNA差异显示分析

目的：应用差异显示技术,筛选鼻咽癌相关基因的异常表达。方法：选用连接有bax基因的真核表达质粒pSFFV-bax-neo, 采用脂质体转染法, 将其转染到CNE2细胞中, 以转染有空载的pSFFV-neo 质粒的CNE2细胞为对照, 采用Trizol试剂快速抽取法, 提取mRNA经逆转录成cDNA,用锚式引物和随机引物进行PCR扩增, 加入同位素, 用6%的测序变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳PCR产物进行分离。切下聚丙烯酰胺凝胶上明显的6条差异带, 回收差异cDNA, 进行第二次PCR扩增, 经低溶点琼脂凝胶回收, 获取大量PCR扩增的差异cDNA片段,同位素标记作为探针, 抽取RNA, 进行点样, 杂交, 洗膜放射自显影等步骤, 进行细胞RNA的Northern印迹斑点杂交。结果：表明4条cDNA片段均为CNE2细胞表达片段。结论：发现bax可诱导CNE2细胞中有某些相关基因表达,并抑制了CNE2细胞某些相关基因表达。     

人单个中性粒细胞IL-8RβmRNA丰度的相对半定量研究

目的：探讨单个中性粒细胞中白介素-8β型受体（IL-8Rβ）mRNA的表达丰度。方法：采用倍比稀释相对定量单细胞RT-PCR方法分离纯化人外周血中性粒细胞并提取总RNA,针对IL-8RβmRNA设计引物,进行RT—PCR确认IL-8Rβ在中性粒细胞中的基因表达并优化反应条件。收集单个中性粒细胞胞内容物或完整细胞,以相同引物进行RT反应,再将后者所得的cDNA倍比稀释后,与前者共同经过两轮PCR扩增,并将最终产物以BamHI内切酶酶切鉴定产物的特异性。结果：IL-8RβmRNA在人中性粒细胞中有大量表达,单个中性粒细胞中亦能扩增出特异性的IL-8Rβ目的条带,并且将单个细胞内mRNA稀释100倍后仍可扩增出目的条带,BamHI内切酶酶切反应证实为目的产物。结论：人中性粒细胞表达IL-8RβmRNA,mRNA倍比稀释单细胞RT—PCR方法确认其丰度远高于一般mRNA含量,且此方法可在单细胞水平比较细胞内mRNA的丰度。     

大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP质粒构建及其在HEK293细胞中的表达

提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增μ型阿片受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,纠正点突变后,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,测序及酶切结果表明μ基因正确,μ-pIRES2-EGFP质粒构建成功.用脂质体法将μ-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫组化荧光可以观察到μ基因的高强度表达.     

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术,结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV）,采用MHV－3,MHV－A59病毒株感染DBT细胞,37℃培养,待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物,进行RT－PCR扩增,结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA,同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

用磁性分离RNA直接进行逆转录PCR

逆转录PCR(RT-PCR)技术是将提取的IRNA先逆转录为cDNA,然后再对该cDNA进行PCR扩增。该技术不仅可用于各种内源及外源性正常及异常RNA的分析或检测,而且还常用于cDNA文库的构建及特定基因的制备。RT-PCR所用RNA模板一般是未经纯化的总RNA,若RNA模板含量较低便难以     

肝素对逆转录抑制作用的研究

目的:研究肝素在逆转录过程中的作用.方法:提取人肺胚胎二倍体细胞和肝素抗凝血中总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量好后,逆转录合成相应的cDNA,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;用基因芯片技术检测cDNA.将肝素抗凝血中提取的总RNA分为等量的两部分,分别用肝素酶或氯化锂处理RNA进行逆转录为cDNA和RNA合成cDNA后再用肝素酶或氯化锂处理,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;并用基因芯片技术检测氯化锂处理RNA后cDNA.结果:二倍体细胞来源的RNA为模板,能扩增出β-actin产物,并且在基因芯片上有杂交点.肝素抗凝血来源的RNA,在肝素酶或氯化锂作用后行逆转录者,能扩增到β-actin的目的片段,且基因芯片上有杂交点;而在未处理者不能扩增到目的片段,且基因芯片上无杂交点.结论:肝素是一种逆转录的抑制剂.对RNA逆转录cDNA过程有较强的抑制作用.     

西部马脑炎病毒基因组序列的半套式RT-PCR检测

为进一步提高RT－PCR检测西部马脑炎病毒（WEE）病毒基因组方法的敏感性,采用半套式PCR扩增病毒基因组特异序列,首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA,然后以此cDNA为模板,进行扩增。对扩增后电泳检查无可见DNA条带的产物进行半套式PCR;与此同时对扩增的循环数、Mg^ 浓度和退火温度等条件进行了优化,以进一步提高扩增的特异性。结果第一轮PCR未扩出特异笥片段的WEE病毒稀释度,其半套式扩增出特定大小的DNA产物;同时优化的条件提高了扩增产物的特异性。扩增产物约为190bp的单一DNA片段,其大小与预期的相一致,结果表明采用半套式RT－PCR方法检测WEE病毒的基因组序列的敏感性可提高100倍以上。     

K-Rasa^G12D基因突变体慢病毒载体的构建及其鉴定

目的：构建K-RasGl2D基因突变体慢病毒载体。方法：从病人组织中提取RNA通过RT—PCR反转录获得cDNA作为K-RasGl2D基因模板,通过PCR法扩增出K-RasGl2D基因突变体片段。将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV—MCS—EF1-RFP中,构建K-RasG12D基因突变体逆转录病毒真核表达载体。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5a,挑取转化平板上的细菌克隆,在抗生素培养液中培养过夜后进行PCR鉴定。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果：所构建的K-RasGl2D突变体基因逆转录病毒真核表达载体经PCR鉴定和测序鉴定正确,转染293T细胞后可以观察到可检测到高强度表达的RFP荧光信号。结论：成功构建了重组真核表达载体,为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究K-Ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。     

慢性髓细胞性白血病病人骨髓单个核细胞中差异表达基因的筛选

目的:筛选慢性髓细胞性白血病(CML)病人骨髓单个核细胞与正常人的差异表达基因,探讨CML的发病机制.方法:提取正常人和CML病人单个核细胞的RNA,逆转录成cDNA并用地高辛标记,应用全基因组表达谱基因芯片对差异表达基因进行研究,采用Jubilant病理/疾病分类法对CML相关差异表达基因进行分析.结果:共筛选出CM...     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的克隆人生长抑制因子家族（inhibitor of growth famility member4,ING4）基因,构建其真核表达载体pEGFP—ING4。方法提取人胎盘总RNA,经RT—PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP—C2载体,构建的真核表达载体pEGFP—ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达。结果RT—PCR产物为750bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的蛋白融合表达。结论从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究1NG4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础。     

RT—nested PCR检测肾综合征出血热患者血清病毒核酸

采用异硫氰酸胍－酚－氯仿（ＡＧＰＣ）一步法提取病毒ＲＮＡ,并依据肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）核蛋白（ＮＰ）编码基因保守区核苷酸序列合成两对巢式引物,建立了逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测ＨＦＲＳＶＲＮＡ方法,应用此法对ＨＦＲＳＶ感染的ＶｅｒｏＥ６细胞培养液及ＨＦＲＳ患者血清中的病毒ＲＮＡ进行检测。结果显示,感染细胞培养液及３５例ＨＦＲＳ患者血清均为阳性,正常的ＶｅｒｏＥ６     

两种微量RNA扩增方法的比较研究

本研究通过比较体外转录和单引物扩增这两种扩增微量RNA的不同方法,以寻找一种高效的扩增方法。我们用两种不同方法分别扩增小鼠大脑全皮层及第五皮层细胞的RNA,扩增的RNA合成cDNA后进行荧光定量PCR实验,根据PCR结果比较两种不同扩增方法的效率。WT-ovation扩增RNA的效率约为IVT效率的2.8倍;IVT方法扩增后,基因D-C值与引物距离mRNA 3'端的长度及mRNA的长度均存在正线性相关(P<0.05),即引物距离mRNA的3'端越近、mRNA越短,基因D-Ct值越低。而WT-ovation方法扩增后,基因D-Ct值与引物距离mRNA 3'端的长度及mRNA的长度均不存在统计学相关性。与IVT方法相比,WT-ovation方法效率更高,扩增时受影响因素较少、更稳定。     

Detection of biomarker gene expression by real-time polymerase chain reaction using amplified ribonucleic acids from formalin-fixed random periareolar fine needle aspirates of human breast tissue

OBJECTIVE: To address the detection of breast cancer biomarker gene expression in formalin-fixed random periareolar fine needle aspiration (RPFNA) samples of benign breast tissue collected during breast cancer prevention trials by quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). STUDY DESIGN: Formalin-fixed breast epithelial cells collected by RPFNA and processed as thin layer preparations were isolated by laser capture microdissection (LCM). Ribonucleic acid (RNA) was extracted and amplified using a single round of T7-based linear amplification followed by quality assessment and biomarker assay using TaqMan chemistry. RESULTS: More than 80% of RPFNA samples yielded RNA of sufficient quantity and quality for measurement of a panel of biomarker genes following a single round of linear amplification. RNA and protein expression for estrogen receptor alpha, as assessed by LCM/qPCR and immunohistochemistry, were correlated. Amplification plots were similar for cDNA standards and cDNA derived from RPFNA samples. CONCLUSION: Assessment of gene expression using amplified RNA from microdissected formalin-fixed RPFNAs can increase the number of biomarkers used during breast cancer chemoprevention trials.     

改进竞争性RT-PCR法测定缺碘大鼠颅骨中BMP-2基因表达变化

为更加精确地测定碘缺乏状态下大鼠颅骨组织中骨形态发生蛋白 2 (BMP 2 )mRNA表达水平 ,改进竞争性RT PCR方法 ,探讨碘缺乏对骨骼发育影响的分子机制 .将构建的DNA竞争模板克隆入pSportⅠ质粒中 ,利用pSportⅠ质粒中所含有的SP6RNA聚合酶启动子序列 ,将DNA竞争模板在体外转录成为RNA .以此RNA作为竞争性RT PCR中的竞争模板 ,与所提取的总RNA一同进行RT PCR ,消除逆转录效率对定量结果的影响 .定量检测碘缺乏和正常大鼠颅骨总RNA中BMP 2mRNA的水平 .碘缺乏大鼠 (1d～ 84d)颅骨中BMP 2表达含量明显降低 .1d时降低 6 4 3倍 ,以后差距逐渐缩小 ,至 84d相差 1 5 5倍 .结果提示 ,碘缺乏所致的骨骼发育不良与BMP 2表达不足有关 ,结果首次揭示微量元素碘和甲状腺激素与BMP 2基因表达的调控有关     

甘薯叶片超氧化物歧化酶基因克隆及测序

以甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔａｓ（Ｌ．）Ｐｏｉｒ）叶为材料提取植物总ＲＮＡ,经反转录后,利用多聚酶链式反应技术,扩增并克隆超氧化物歧化酶基因的ｃＤＮＡ,并进行测序分析。该序列全长４８２ｂｐ,其读码框编码１５２个氨基酸,与国外文献报道的甘薯块根ＳＯＤ基因的ｃＤＮＡ序列相比,具有９９％的同源性。