基于ITS2序列的獐牙菜属六种药材的分子鉴定

本文以獐牙菜属的六种药材为研究对象,采用MEGA 6.0软件确定ITS2序列的GC含量,基于K2P模型计算遗传距离,构建NJ树,ITS2 database在线分析二级结构等方法,研究ITS2条形码序列对六种药材的鉴别效果。结果表明,六种药材的ITS2序列长度范围为230~232 bp,平均GC含量为61.2%~64.0%。六种药材的种内变异均较小,其种间平均遗传距离为0.03~0.09。ITS2二级结构的茎环结构和四个臂均不同,NJ树结果显示,六种药材可分别聚为一支,呈现出明显的单系性。因此,ITS2序列可准确、有效地鉴别本研究的獐牙菜属六种药材,为这些药材的后续相关深入研究奠定了基础,也为獐牙菜属其他物种鉴定提供了参考。     

基于条形码ITS2序列的青天葵及其混伪品分子鉴别

通过分析青天葵及其常见混伪品的ITS2序列,建立青天葵新型真伪鉴别方法.采用植物基因组DNA提取试剂盒提取青天葵及其混伪品的叶片DNA,一对通用引物PCR扩增ITS2基因片段并直接双向测序.采用DNAMAN、ClustalX软件拼接比对序列,MEGA4.0软件构建NJ树,Schultz等建立的数据库和网站预测ITS2序列的二级结构.结果显示,获得的12条ITS2序列的长度范围为203-242 bp,GC含量范围为53.1％-71.8％.所有样品ITS2序列比对后的长度为249 bp,其中存在226个变异位点.青天葵种间K2P遗传距离(1.125)远大于种内K2P遗传距离(0.004).基于ITS2的序列的NJ树和二级结构均能直观地区分青天葵及其混伪品.     

基于ITS序列的新疆野苹果系统发育分析

利用PCR和DNA测序技术,获取3个居群新疆野苹果的ITS序列,并结合GenBank里已有的中亚地区的新疆野苹果、欧洲苹果、栽培苹果和东方苹果的ITS序列进行比对分析,利用MEGA5.0软件选择＂ Krima2-Paramenter＂核酸距离模式获得遗传距离矩阵,用邻接法（neighbor-joining,NJ ）进行独立的系统发育分析,结果显示,所有供试材料的ITS1的长度为209~224 bp,GC含量为66.1%~66.9%,ITS2的长度为201~290 bp,GC含量为65%~71.5%,遗传距离为0~0.21,进化树分为三支.新疆野苹果的遗传多样性与地理分布有正相关关系,不同居群之间存在基因交流.     

基于ITS序列分析钩苞大丁草九个居群的亲缘关系

该研究对我国西南地区钩苞大丁草(Gerbera delavayi)9个居群rDNA ITS序列进行PCR的扩增和检测序列,并以非洲菊(G.jamesonii)的ITS序列作为外类群,比较了序列之间的差异,同时分析了钩苞大丁草不同居群在地理距离与遗传距离之间的关系,构建了NJ系统发育树。结果表明:(1)钩苞大丁草9个居群的ITS序列全长介于600~700 bp之间,平均长度约为657 bp,其中,ITS1长度为243~246 bp,(G+C)含量为45.67%~46.80%之间,5.8S长度191~193 bp,(G+C)含量为58.60%~58.61%之间,ITS2长度为220~221 bp,(G+C)含量为57.00%~57.45%之间;ITS序列共有22个变异位点,ITS1序列(17个)、5.8S序列(2个)以及ITS2序列(3个)上均有变异。(2)地理距离与遗传距离有正相关(r2=0.652),序列间遗传分化距离为0.001 1~0.024 3,其中普洱居群与其他居群间遗传距离最大。(3)钩苞大丁草9个居群分成三个分支,普洱居群单独成支,丽江和洱源居群聚为一支,富源、武定、德昌、石林、新平和开远6个居群聚为一支。rDNA ITS序列可以用于钩苞大丁草群体遗传研究的分析,该研究结果为其保护性开发提供了参考依据。     

维吾尔药材红豆杉植物基原研究

从分子学角度探明维吾尔药材红豆杉的植物基原,为维吾尔药材标准化与维吾尔药产业化提供科学依据。采用试剂盒法提取红豆杉属植物及药材基因组DNA,PCR扩增ITS2片段,双向测序,应用Mega 6.0软件分析序列,计算种内及种间遗传距离,构建NJ鉴别树。红豆杉属植物ITS2序列长度为229~231bp,GC含量为59.13%~60.26%;西藏红豆杉与红豆杉及南方红豆杉种内种间K2P距离为0,与东北红豆杉、命叶红豆杉及曼地亚红豆杉种间K2P距离分别为0.012、0.013、0.015。NJ树结果表明,西藏红豆杉与红豆杉及南方红豆杉无法区分,与东北红豆杉、命叶红豆杉可区分;曼地亚红豆杉与其母本东北红豆杉聚在一起,无法区分。根据ITS2序列鉴定结果,西藏红豆杉与红豆杉、南方红豆杉可作为药材的同一基原,东北红豆杉可与曼地亚红豆杉作为同一基原,为维吾尔药材的真伪鉴别及质量标准提升提供基原鉴定依据。     

不同产区厚朴nrDNA ITS序列分析及亲缘关系鉴定

以陕西、四川、浙江、重庆、福建、广西主产区的11个种源厚朴为材料,采用PCR直接测序法,测定不同产区厚朴的核糖体DNA ITS区序列,并结合GeneBank中相关植物的ITS序列（以同属近缘物种辛夷为外类群）,应用Kimura 2遗传距离与NJ系统树分析法对不同产区厚朴的亲缘关系进行分析。结果表明：11个产区厚朴的ITS全序列长度介于593～600 bp,其中,ITS1长度为214～217 bp,G+C含量为54.42%～5535%,ITS2长度为215～219 bp,G+C含量为59.82%～60.95%;ITS序列共有36个变异位点,均出现在ITS1（7个）和ITS2（29个）序列中,虽然位点变异与部分叶形变化出现吻合,但无必然联系;序列间遗传分化距离为0.000～0.02792,11个产区厚朴构成3个分支,显示出产区间厚朴的亲缘关系,其中陕西洋县（SXYX）、陕西西乡（SXXX）、福建武夷山（FJWYS）及四川彭州（SCPZ）四个产区ITS序列完全一致。nrDNA ITS序列分析可作为厚朴不同产区亲缘关系鉴定的手段。     

鲽科10种鱼类核糖体ITS2序列比较分析

为了解鲽科鱼类ITS2序列的多态性特征,本研究获得了鲽科10种鱼类310条ITS2序列,长度在419 ~ 486 bp之间。种内序列长度差异最小的为粒鲽（Clidoderma asperrima）（419 ~ 420 bp）和太平洋拟庸鲽（Hippoglossoides elassodon）（419 ~ 420 bp）,其次为北岩鲽（Lepidopsetta polyxystra）（447 ~ 452 bp）和刺黄盖鲽（Limanda aspera）（457 ~ 463 bp）,松木高眼鲽（Cleisthenes pinetorum）（452 ~ 462 bp）和圆斑星鲽（Verasper variegatus）（465 ~ 479 bp）的种内序列差异分别为10 bp和14 bp;其余4种鱼类根据长度差异（14 ~ 32 bp）分型为长（A型）、短（B型）序列类型,同时检测存在重组类型（R型）,其中长度差异最大的是钝吻黄盖鲽（Pseudopleuronectes yokohamae）（454 ~ 486 bp）,其次为尖吻黄盖鲽（P. herzensteini）（433 ~ 458 bp）、虫鲽（Eopsetta grigorjewi）（420 ~ 439 bp）、星突江鲽（Platichthys stellatus）（466 ~ 480 bp）。通过双参数模型（K2P）计算遗传距离可见,种内遗传距离多集中于0.002 ~ 0.027之间,仅星突江鲽和尖吻黄盖鲽因类型差异导致较高数值（0.043和0.053）;不同物种间遗传距离在0.046 ~ 0.180之间。10种鱼类ITS2的GC含量为63.95% ~ 70.16%;9种鱼类的二级结构均为具有5个分支（HelixⅠ ~ Ⅴ）的闭合环状结构,仅圆斑星鲽中由于存在Helix Ⅳ变异形成Helix Ⅳ-a和Helix Ⅳ-b而具有6个分支。基于ITS2构建的鲽科10种鱼类的系统进化树显示,不同种鱼类的克隆序列均单独聚支。序列的多态性特征分析表明,在具有不同序列类型的虫鲽、星突江鲽、尖吻黄盖鲽和钝吻黄盖鲽4种鲽科鱼类中,ITS2以非协同进化的方式存在,而其他6种鱼类为协同进化;虽然存在种间K2P遗传距离小于种内的个例,但ITS2在属间不同物种的区分上具有适用性。本研究结果丰富了鲽形目鱼类的ITS2数据,也将为鱼类的核糖体RNA序列多态性的研究提供科学依据。     

基于DNA条形码鉴定植物药常山及其混伪品

虎耳草科（Saxifragaceae）常山属（Dichroa）植物常山（Dichroa febrifuga Lour.）是我国著名的抗疟药物。但目前全国各地使用较为混乱,代用品、混淆品多,鉴定困难。本研究收集常山及其混伪品6种,共64份样品,利用DNA条形码和二维DNA条形码技术进行物种鉴定研究。研究结果表明,DNA条形码技术可准确鉴定常山及其混伪品,20%的常山样品存在混伪现象,混伪品主要为阔叶十大功劳（Mahonia bealei（Fort.） Carr.）。常山ITS2序列长度为230 bp,种内K2P遗传距离为0~0.0253,常山及其混伪品种间K2P遗传距离为0.152~0.748。基于ITS2序列构建的NJ树显示,常山及其混伪品能够明显区分,可为临床安全用药提供科学依据。成功构建常山的二维DNA条形码鉴定体系,实现“互联网+”的跨平台信息交换,可为二维DNA条形码技术在流通监管领域的实践应用提供理论基础。     

栽培种甘薯及其近缘野生种nrDNA ITS序列分析

采用核糖体DNA内转录间隔区(nrDNA ITS)序列比较分析了甘薯及其近缘野生种的遗传多样性及系统进化关系,首次报道了栽培种甘薯‘徐薯18’(Ipomoea batatas‘Xushu18’)及其近缘野生种I.triloba(DOM),I.cordatotriloba(MEX),I.nil(PER),I.nil(JPN),I.hederacea Jacq.(USA),I.hederacea Jacq.(HK)和种间杂交种67-1(I.batatas‘Xushu18’×I.hederacea Jacq.)及回交种(67-1×I.batatas‘Xushu18’)的nrDNA ITS序列。序列分析表明,栽培种甘薯及其近缘野生种nrDNA ITS序列长度为570~600bp。其中,ITS1序列为185~209 bp,GC含量为53.11%~61.83%;ITS2序列为214~226 bp,GC含量为61.21%~72.89%;5.8S序列均为165 bp,GC含量为54.55%~55.76%。此外,栽培种甘薯及其近缘野生种ITS序列信息位点均集中在ITS1和ITS2区;与其他甘薯属植物相比,I.wrightii ITS2的末端缺失了6~8个碱基。系统进化分析表明,栽培种甘薯‘徐薯18’(I.batatas‘Xushu18’)和野生种I.triloba、I.cordatotriloba、I.lacunosa、I.trifida的亲缘关系较近,与I.wrightii、I.pes-tigridis、I.grandifolia、I.nil、I.hederacea Jacq.、I.purpurea的亲缘关系较远;杂交后代与栽培种甘薯‘徐薯18’(I.batatas‘Xushu18’)亲缘关系较近,与野生种父本I.hederacea Jacq.的亲缘关系较远。     

老芒麦和垂穗披碱草rDNA-ITS序列分析

分析了老芒麦和垂穗披碱草rDNA-ITS序列,为这两个种的鉴别提供分子指纹图谱,为系统发育提供分子生物学依据。结果表明,22份材料的ITS、ITS1、5.8S、ITS2序列长度均相同,依次为604bp、222bp、164bp、218bp,GC含量依次为62.25%～63.08%,62.16%～63.06%,59.76%,64.22%～65.60%。除5.8S外,碱基位点都有不同程度的变化,一些变异位点有明显的种性变异规律,可作为老芒麦和垂穗披碱草种质DNA指纹特异鉴别位点。7个ITS序列的同源性98.7%～99.8%,遗传分歧0.2～1.3,具有保守性,为非近期分化类群。系统发育分析表明不同来源地的同种材料,差异主要表现在DNA变化快慢及碱基替换数,但相同的种归为一类,进一步反映了种内的遗传稳定性。     

叶下珠药材HPLC指纹图谱的比较研究

采用反相高效液相色谱法,对叶下珠药材不同产地、不同采收期、不同部位指纹图谱进行测定和比较分析,并与中成药叶下珠胶囊的HPLC指纹图谱进行了比较研究。结果显示:(1)建立了叶下珠药材的HPLC特征指纹图谱,标定18个共有峰,利用对照品指认4个峰;11批(来源地不同)叶下珠样品的HPLC图谱相似度(相合系数,均值)在0.89~0.99之间。(2)7批不同采收期的叶下珠药材的HPLC指纹图谱相似度在0.94以上,各共有峰的峰面积大多随生长期而增加,至10月5日达到最高,建议叶下珠药材应于每年的10月上旬进行采收。(3)不同部位叶下珠药材HPLC指纹图谱相似度分析发现,叶、果的相似度较高(0.98~0.99),根、茎的相似度较低(0.86~0.87),说明根、茎中各成分含量较低,建议采收叶下珠药材的地上部分即可。(4)比较叶下珠胶囊和叶下珠药材的指纹图谱,发现二者的化学成分非常相似,但峰面积差异较大,其差异可能是由于加工过程所致。该研究所建立的HPLC指纹图谱分析方法简便、重现性好,可用于叶下珠药材及中成药的鉴定与质量评价。     

中药乌头及其近缘种的rDNA—ITS序列分析

运用PCR扩增产物直接测序的方法对云南、安徽的乌头及其近缘种植物的ITS区碱基序列测定。表明核糖体DNA中ITS区的完整序列（包括ITS1,ITS2和5．8s）,4种乌头属植物的ITS1序列长度为249bp,云南鸟头和安徽乌头及黄山鸟头ITS2序列长度为189bp,赣皖乌头ITS2序列长度为217bp。运用Mega2软件进行系统分析得到系统进化树。ITS序列特征是乌头鉴别的有效分子标记。     

23株不同地理来源嗜酸硫杆菌的系统发育及其遗传差异

【目的】研究不同地理来源嗜酸硫杆菌的系统发育及其遗传差异,以及基因指纹图谱技术聚类与嗜酸硫杆菌地理来源的相关性。【方法】采用16S-23S r RNA间隔区(ITS)序列建立系统发育树,并结合ERIC和BOXAIR两种引物进行rep-PCR,以及rus基因扩增,对不同地理来源嗜酸硫杆菌进行分析。【结果】分离自不同样点的23株嗜酸硫杆菌遗传差异显著,依据ITS序列系统发育树被划分为5个大类群,与rep-PCR指纹图谱的分类结果较为接近,其中Acidithiobacillus ferrooxidans在ITS系统发育和BOXAIR-PCR指纹聚类分析中被划分为2个类群,但在ERIC-PCR中归为1个类群,rus基因分组中,在系统发育和聚类分析中处于同一类群的菌株拥有不同类型的rus基因,说明嗜酸硫杆菌的亚铁氧化途径与系统发育类群无明显相关性;ITS基因拥有区分近缘种或亚种的能力,且BOXAIR-PCR的分辨能力较强,非常适于嗜酸硫杆菌的遗传差异分析。     

紫花地丁HPLC指纹图谱研究

目的:建立紫花地丁药材HPLC指纹图谱,提供药材质量控制的可靠方法。方法:采用HPLC方法,以Agi-lent C18(4.6 mm×250 mm,5μm)为色谱柱,甲醇-0.5%醋酸水溶液进行梯度洗脱;检测波长353 nm,流速1.0mL/min。结果:检测了12批不同来源的紫花地丁药材,确立了18个共有峰,建立了紫花地丁对照指纹图谱,计算各被测样品的HPLC指纹图谱的整体相似度,并指认了菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素、早开堇菜苷4个特征峰,比较了上述成分在不同药材中的含量。结论:所建立的指纹图谱具有良好的精密度、重现性和稳定性,可作为紫花地丁药材质量控制标准。     

基于HPLC指纹图谱的亳白芍不同炮制品标准汤剂7个成分含量测定

建立亳白芍不同炮制品标准汤剂HPLC指纹图谱,其中生白芍、炒白芍和酒白芍标准汤剂分别标定16、14和13个共有峰,同时测定亳白芍不同炮制品标准汤剂中7种化学成分(没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷)含量,经炒制后标准汤剂中芍药内酯苷和苯甲酸含量升高,氧化芍药苷、芍药苷含量降低,酒白芍标准汤剂中芍药苷含量升高,苯甲酸含量降低,并对含量测定结果进行聚类分析,同一批亳白芍及其炮制品可聚为一类,但聚类距离缩小后生品和炮制品各聚为一类。建立的HPLC指纹图谱和含量测定方法具有良好的重现性,且简便快速,二者结合可直观反映出亳白芍炒制、酒制后的变化差异。     

贵州桐梓何首乌rDNA ITS序列分析

以改进的CTAB法对何首乌总基因组DNA进行提取,采用通用引物对不同来源的何首乌rDNA ITS序列进行PCR扩增、测序和序列分析.结果表明,何首乌rDNA完全序列片段长度共约652 bp,其中ITS1的长度为202 bp,5.8S的长度为161 bp,ITS2长度为232 bp,与其近缘种ITS序列间存在明显差异.其rDNA ITS序列在分子水平上为鉴别何首乌提供了参考依据.     

美国西部不同地区Grayia spinosa核DNA ITS序列分析

藜科植物Grayia spinosa是美国西部地区的特有种,多生长在干旱盐碱地,具有重要的生态价值。该研究测定了采自美国西部犹他州G.spinosa的nrDNA ITS序列,与Gen Bank中已提交的G.spinosa的所有ITS序列以及G.spinosa的四个近缘种作为外类群进行比较,分析了美国西部不同地区G.spinosa ITS序列的一级结构与其RNA二级结构的变异规律。结果表明:所有G.spinosa样品的nrDNA ITS序列长度在611~623 bp之间,GC含量在60.35%~61.0%之间,序列间共存在22个变异位点,5个为简约信息位点。各样品间的遗传距离在0.001 8~0.008 9之间,不同样品间的遗传距离与地理距离的相关性不显著。邻接法构建的系统发育树显示所有G.spinosa聚为一大支,与外类群形成明显分支。此外,利用RNAfold在线软件预测了G.spinosa ITS序列的RNA二级结构,将8个G.spinosa样品的RNA二级结构根据构型差异大体上分为四类,分别记为type A,B,C和D四类,主要变异出现在ITS1和ITS2区。所不同的是在G.spinosa ITS的一级结构分析中GSNE1与GSWA8体现出更近的亲缘关系,但二者的RNA二级结构差异明显,同时GSNE2、GSUT3、GSUT4、GSCA5、GSCA6、GSCO7在ITS序列一级结构分析中也体现出较近的亲缘关系,但是他们的RNA二级结构差异明显。这可能与ITS序列的RNA二级结构在进化中体现出更大的保守性有关。     

玄参饮片质量控制方法研究

研究中药质量评价中一测多评与指纹图谱结合的考察模式,以重庆市售玄参饮片为研究对象,以肉桂酸为参照物建立玄参饮片HPLC指纹图谱及其与其余成分的相对校正因子,并计算其含量,实现一测多评。结合建立的玄参HPLC指纹图谱,对饮片进行相似度评价,并进行聚类分析和主成分分析。结果建立了玄参饮片HPLC指纹图谱,标定了18个共有峰,指认了其中3个共有峰,11批饮片相似度在0.731~0.960之间,16批饮片中只有11批饮片含量符合药典规定,并将其有效地区分为三类。结果表明一测多评结合指纹图谱的质量控制模式适合于玄参饮片质量评价,重庆市售玄参饮片质量参差不齐,应加强中药饮片的规范化生产。     

不同种源何首乌的ITS序列分析及其亲缘关系研究

采用PCR直接测序法,测定了10个种源何首乌的核糖体DNA ITS区序列,并结合GenBank中相关植物的ITS序列(以萹蓄Polygonu maviculare为外类群),应用遗传距离与系统树分析法对不同种源何首乌的亲缘关系进行了分析。结果表明:(1)ITS1序列长度为195bp,G C含量为69.23%~72.31%,ITS2序列长度为189bp,G C含量为77.25%~80.95%,序列间遗传分化距离为0.00175~0.04945;(2)10个种源何首乌构成2个分支,广西田阳种源自成一支,与其它种源亲缘关系较远;(3)结合形态、分布与化学成分,支持将田阳何首乌作为何首乌的一个变种——棱枝何首乌。     

滇重楼的psbA-trnH条形码分子鉴定研究北大核心CSCD

为探讨滇重楼药材鉴定新方法,本研究通过对重楼样品提取基因组DNA,PCR扩增叶绿体psb A-trn H序列并进行双向测序,所得序列经Codon Code Aligner拼接后,采用MEGA5.0软件进行序列比对,计算种内和种间遗传距离(K2P),构建邻接数(neighbor-joining tree)进行结果分析。研究表明,叶绿体psb A-trn H片段在滇重楼种内变异较小,平均K2P遗传距离为0.007,而滇重楼与其它重楼种间平均K2P遗传距离为0.025,滇重楼种间最大K2P遗传距离明显小于滇重楼与重楼属其它种内的最小K2P遗传距离。中药材DNA条形码鉴定系统比对和NJ树鉴定结果均表明psb A-trn H序列可区分滇重楼及其同属物种,且具有较好的稳定性和准确性,为保障临床安全用药提供了新的技术手段。