用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达人生长激素

利用Bac to Bac杆状病毒载体表达系统将人生长激素 (humangrowthhormone ,hGH)基因cDNA克隆至转移载体pFastBac1中 ,得到pFastBac hGH ,再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中 ,发生转座作用 ,得到含hGH基因的重组穿梭载体rBacmid hGH .纯化DNA ,直接转染培养的昆虫细胞Sf9,得到重组病毒rAcV Bac hGH .经酶切PCR及Southern杂交鉴定 ,hGH基因正确地插入病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下 ,SDS PAGE测得产物蛋白分子量为 2 2kD左右 .用免疫化学发光法测得转染上清中hGH表达水平可达 18μg ml ,与用传统的BEVS表达hGH相比 ,转染上清中hGH表达水平提高 4 0 0倍以上     

转人生长激素鼠胚成纤维细胞的暂态表达方法的初步确立

探讨作为转基因克隆动物核供体的、不具备分泌人生长激素（hGH）功能的转hGH鼠胚胎成纤维细胞（tEF）体外表达人生长激素的简便的暂态表达方法。首先,转染,3d后筛选出G418,与无hGH分泌的人乳腺癌细胞株（MCF-7）在聚乙二醇（PEG）作用下融合,培养1～2d,放射免疫分析方法检测相同数量的MCF-7组、转染MCF-7组、tEF组以及融合细胞共4组培养液中hGH的表达。结果显示tEF组和MCF-7组均无hGH表达;二者的融合细胞组培养液中hGH表达量可高达0.84mIU/L。可见,不表达hGH的tEF与MCF-7融合形成的杂种细胞,可作为暂态表达系统检测转基因细胞的表达。     

人生长激素基因在哺乳动物培养细胞中的导入与表达

将小鼠金属硫蛋白I(MT—I)启动子置换人生长激素(hGH)基因的启动子,构建成MT—hGH嵌合基因。当与疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因(tk)的质粒共转染小鼠L—tk-细胞,在tk⁺转化细胞中所整合的MT-hGH基因可被重金属镉诱导。获得可表达和分泌hGH的细胞株,其中一株hGH的产率为2．5μg／10⁶细胞／24h．所产生的hGH分子量为22000道尔顿,表明小鼠L一tk+细胞株能对外源hGH基因所产生的mRNA进行正确的加工并能删除激素原的信号肽。     

hGH消化道途径转基因的研究

消化道途径转基因过程方便、快捷、易适应,可为基因治疗提供全新的模式。为了研究人 生长激素(bGH)基因的经消化道途径转基因过程,实验首先应用ECHO克隆系统。在供载体 pUni-hGH和宿主载体pcDNA4／TO-E的基础上,构建出hGH的哺乳动物表达载体pcDNA4-hGH;然 后结合酿酒酵母表达载体pESC-URA,构建出hGH的酵母-哺乳动物穿梭栽体pESC-CMV-hGH,测 序鉴定后转化酿酒酵母。用阳性重组酵母对小鼠进行灌胃免疫实验,间接ELISA方法在实验组 小鼠的血清中检测到抗hGH抗体的存在。结果证实hGH基因可通过消化道途径转进小鼠体细 胞并进行表达,初步证明了hGH的消化道基因治疗的可行性。     

生长激素对氨基酸转运和蛋白质合成有急性兴奋效应

生长激素(GH)对不同组织中的氨基酸转运和蛋白质合成有急性兴奋作用,但这些效应是生长激素的促生长作用还是独立的胰岛素样的作用,至令没有得到证实。与天然的人生长激素(22K hGH)相比,分子量为20000道尔顿人生长激素的变异体(20K hGH)的促生长活性与胰岛素样活性的比值很高,因此,它可作为探讨上述问题的工具。作者用雌性去垂体大鼠离体的膈肌进行实验,比较天然22K hGH 与变异体20K hGH 刺激氨基酸转运与蛋白质合成的相对活性。将一对完整的偏侧膈在不同浓度的22K hGH 或20K hGH存在或缺如的情况下预先孵育1h,在孵育的最后1h 内,在孵育液中加~(14)C 标记的3-氧-甲基葡萄糖,以测定 hGH 在糖转运中的胰岛素样活性,同肘亦加入~3H 标记的α-氨基异丁酸或~3H 标记的苯丙氨酸,分别     

两个人生长激素基因在SV40病毒重组体感染的猴细胞中的表达

我们已经建造了带有两个不同的人生长激素(hGH)基因的SV40重组体。用这些重组体感染的猴肾细胞能合成、加工并分泌人生长激素。有着与克隆的人生长激素互补DNA(eDNA)同样编码序列的基因1,共产物从几个标准来看,与垂体hGH没有什么区别。预定编码一个变异蛋白质的基因2,其产物比垂体hGH的免疫反应活性要小,但能有效地与hGH细胞表面受体结合。这些结果表明,基因2有可能表达而产生我们以前未辨别的hGH形式。这些结果显示了在真核细胞中,用基因转移的方法产生成熟的激素是可能的。这些结果也证明了SV40—猴细胞系统可以用于生产和鉴定动物细胞分泌的蛋白质。     

活化素抑制大鼠垂体GH_3细胞中人生长激素基因启动子的活性

本研究旨在探讨活化素(activin)对大鼠垂体GH3细胞中人生长激素(hGH)基因启动子活性的影响及其可能的调节机制。采用荧光素酶报告基因方法。首先建立含hGH基因启动子(-484～+30bp)和荧光素酶融合基因的稳定转染GH3细胞株,然后加入活化素或同时加入活化素与相关信号转导途径的激动剂,通过检测细胞培养液和细胞裂解液中GH的含量,以及GH3细胞内荧光素酶的变化,反映活化素对GH分泌、合成和hGH基因启动子活性的影响。将含不同长度hGH基因启动子序列的荧光素酶表达质粒分别转染GH3细胞,观察它们对活化素的反应,寻找活化素影响hGH基因启动子活性的关键DNA序列。结果表明,活化素(5,50nmol/L)能抑制大鼠垂体GH3细胞中GH的分泌和合成,活化素(5,50nmol/L)还能够抑制GH3细胞中hGH基因启动子的活性,使之仅达对照组的77%和69%;在胞内信号转导激动剂中,丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK/MEK)特异性激动剂C6ceramide(1μmol/L)完全取消了活化素对hGH基因启动子活性的抑制作用;活化素发挥抑制作用所需要的hGH基因启动子关键序列位于-132～-66bp之间。上述研究表明,活化素能抑制大鼠垂体GH3中hGH基因启动子的活性,它可能是通过抑制细胞内依赖MAPK的信号转导途径来完成的,同时hGH启动子上-132～-66bp的序列在其中发挥重要的作用。     

生长激素

19世纪末人们在临床工作中已发现生长发育与垂体有关。1912年Ashner发现单纯切除垂体前叶导致生长障碍。1921年Evans等证实牛垂体提取液对大鼠有促进生长作用。1943年Evans建立了生长激素GH的生物学测定方法即胫骨测定法。1944年李卓浩和伊万斯提纯了牛GH,确定了垂体GH的存在。1956年李卓浩等又提纯了人生长激素(hGH),发现GH有高度种属特异性,并使hGH应用于临床治疗有了可能。1962年Hunter等建立了hGH的放射免疫测定法,从而建立了各种hGH功能试验,使hGH功能紊乱疾病包括垂体侏儒的诊断水平显著提高。1971年已能     

hGH确使总身高增长

由Genentech Inc.(S.San Francisco,CA)发起的一项研究表明,用人生长激素(hGH)进行早期治疗可增加身材短小儿童的总身高。这些儿童是非技术性限定的hGH缺乏患者。此报告与一项1994年意大利的研究相矛盾,那项报告的结论是,hGH使身材短小儿童的生长加速,但不增加他们成人后的总身高。 每升血液中hGH含量低于10毫微克的儿童即被确定为hGP缺乏患者。这部分患者群体是目前Genentech公司生产的重组hGH Protropin的销售对象。大约3500个儿童中有一名患者。     

外源基因在鱼类核移植胚胎中的转录起始

比较了hGH转植基因在F4代的转MThGH基因鱼, F4代胚胎细胞的核移植后代, 以及F4代尾鳍培养细胞的核移植后代中的转录时序差异. RT-PCR实验结果表明, hGH基因在转基因鱼F4代胚胎中从原肠早期开始转录; F4代胚胎细胞核移植的后代在囊胚早期已能检测到hGH基因转录本; F4代尾鳍培养细胞核移植的后代自16胞期就出现hGH基因的转录.上述结果表明, 鲤鱼卵细胞质对分化细胞核特定基因的再程序化能力是有限的, 进而推论鱼类细胞核移植试验中仅有少部分的供体核能够发生完全再程序化.     

Genentech公司的人生长激素(hGH)销售量随着竞争性产品进入临床试验而增加

作为已获食品药物管理局(FDA)批准的美国唯一人生长激素(hGH)生产厂家,Genentech(旧金山,加利福尼亚州)截止到1986年第二季度,其重组hGH销售量已升至950万美元。然而,面对Bio-Technology General(BTG)(纽约,纽约州)以及Ares-Serono(波士顿,马萨诸塞州)的竞争,以上情况可能会有变化。这两家公司都在进行重组的自然hGH的临床检验。Genentech的人生长激素(实际上是甲基人生长激素)由于在肽链终端多一个蛋氨酸残基,在某些病人体中会引起免疫反应。 BTG与Serono均宣称他们的hGH没有这种额外基因引起的反应,尽管BTG公司对98个儿童做的试验才有4个月,但在同样短的期间里用Genentech公司的产品作试验已出现问题。     

用于老年人的生长激素

如果六月第一周公布的结果被确认的话,帮助缓解一些老化作用可能成为人生长激素(hGH)一种主要的新用途.曾经有人怀疑老年人中生长激素分泌的减少在降低瘦体重增加脂肪组织量和皮肤变薄中起很大作用.此新研究结果表明,服用生长激素可逆转上述过程. 科学家认为从30岁左右开始,多数个体中垂体生长激素的分泌趋于减少.由于没有实测hGH含量,因而不能确定上述假说,但代替实测hGH,通过测定胞浆的胰岛素样生长因子I(IGF-Ⅰ,或促生长因子C)浓度间接测定了hGH,IGF-Ⅰ由肝脏及其它与     

人生长素基因工程细胞C-4系的无血清培液培养

C-4工程细胞系是整合有hGH和mMT启动子融合基因的CHO dhfr~-细胞,在cd~(++)作用下能够表达并分泌hGH。该细胞系经过驯化,可适应在CBSF-Ⅱ无血清培液中长期生长、传代,同时仍接受cd~(++)的诱导作用,分泌hGH。CBSF-Ⅱ培液中蛋白含量很低(20μg/ml),为了易于获得高纯度产品和降低费用,用于必须以哺乳动物细胞作为转基因靶细胞生产的生物制品,是值得尝试的。     

在细菌中合成人生长激素

控制着人生长激素（(hGH),催乳激素以及 绒毛膜生长激素的各个基因有着共同的起源, 因此,这组基因是研究具有亲缘关系的某些基 因的结构、进化和分化调节的极好模型。hGH 又是治疗垂体衰退性矮小症的特效药物,在治 疗其它失调性疾病上,疗效也很显著。但是,由 于它只能从死尸的垂体中提取,所以远远不能 满足需要。如果能在细菌中合成hGH,对于开 展理论研究和医疗实践都具有重要意义。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

遗传免疫

美国Texas大学的一个科研小组建立了一种新的利用微轰击DNA输送系统的免疫方法。科研人员用含受人β-肌动蛋白启动子和细胞肥大病毒启动子转录控制的人生长激素(hGH)基因组拷贝的质粒接种年幼小鼠。用免疫测定法监测hGH抗体的产生。按种后几周内,88%的小鼠产生了hGH 抗体。为了测定是否起动了初级免疫应答,再次用该种质粒接种曾初次接种并产生过抗体的小鼠。在接种处未出现局部炎症,表明用此技术造成的免疫应答反应可经逐次DNA加强注射加以强化。     

美国学会召集世界的专家讨论服用hGH是否会引起白血病

美罔学会决定会集吐界的专家广泛讨论服用人生长激素(hGH)的治疗会不会促进自血病的发病的悬案。美国小儿内分泌学会5月4～5日在美国华盛顿 D.C.召开。体内的增殖因子和癌症的关系很深。研讨 hGH 与白血球的异常增殖有没有关系,其结果将对增殖因子在医药品中的开发带来影响。会议的成果整理成白皮书,发给美国小儿内分泌学会、欧洲小儿内分泌学会、日本小儿内分泌学会的会员。会议是出 hCH 的最大供给地美国 Genentech公司支助的。怀疑 hGH 与白血病有关的发源地是日本。起源于1986年的小儿内分泌学会上的报告。     

利用毕赤酵母系统表达重组人生长激素的研究

为了获得重组人生长激素在毕赤酵母中高表达的菌株,按毕赤酵母基因密码子偏爱性,人工合成hGH的全基因序列.该基因被克隆到穿梭质粒pPIC9K中,PEG1000介导转入毕赤酵母GS115细胞,通过G418筛选获得高拷贝转化子.在甲醇的诱导下.实现了hGH在毕赤酵母中的成功表达.通过发酵条件的优化.发酵上清中的表达量达1537 mg/L经过超滤和两步层析,重组蛋白的得率这35%,纯度为97%,相对分子质量测定表明重组蛋白的相对分子质量与理论值相近.N-端氨基酸测序证实hGH基因在毕赤酵母中获得正确的表达.     

牛BLG基因5＇调控成分的克隆和制备乳腺生物反应器研究

用PCR法克隆了牛β-乳球蛋白(BLG)基因的 1个片段,它包括 650 bp的 5’侧翼序列,第一二外显子和第一内含子.以该片段中的 650 bP的侧翼序列及转录起始位点下游 11 bP的非编码区(共 661 bP)作为调控序列,与人生长激素(hGH)基因构建成了表达载体,在培养的原代山羊乳腺上皮细胞中进行暂时表达,结果在激素诱导下, hGH基因能够表达,并且表达产物的绝大部分分泌到培养基中.将上述表达载体中的BLG/hGH融合基因部分经显微注射法制得5只转基因阳性小鼠,其中1只小鼠乳清中hGH的含量为420 μg/mL而血清中仅为0.051μg/mL,说明本实验克隆的牛BLG基因5’调控序列可以控制目的基因在转基因动物中表达,基本上具有乳腺特异性,而且产物能分泌至乳汁中.