葫芦巴环阿屯醇合酶基因的分离及其对薯蓣皂素合成的影响

以薯蓣皂素合成植物葫芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)为材料,从中分离了环阿屯醇合酶基因Tf CAS,并对其序列特征、基因的表达及其对葫芦巴薯蓣皂素生物合成的影响进行了分析。结果显示,该基因全长2271 bp,共编码756个氨基酸;其氨基酸序列与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)、豌豆(Pisum sativum L.)及百脉根(Lotus japonicus L.)环阿屯醇合酶氨基酸序列的同源性分别为94%、91%和89%。利用酵母表达系统对Tf CAS蛋白的生物化学功能进行了验证,结果表明该蛋白能够催化环阿屯醇的合成。进一步利用葫芦巴发根遗传转化体系在葫芦巴中过量表达Tf CAS基因,发现该基因的过量表达大幅提高了Tf CAS的表达,且促进了葫芦巴中β-谷甾醇和薯蓣皂素的生物合成,但与对照相比差异不显著。研究结果表明Tf CAS基因参与了葫芦巴薯蓣皂素的生物合成,但其并非为该合成途径中的限速酶。     

水杨酸对菊叶薯蓣中薯蓣皂素生物合成的影响

薯蓣皂素为甾体激素药物合成起始原料,主要来源于菊叶薯蓣等薯蓣属植物的块茎或根状茎,因而关于提高菊叶薯蓣中薯蓣皂素含量的研究有重要意义。利用水杨酸处理菊叶薯蓣的离体植株,研究其对薯蓣皂素生物合成的影响及作用机制。100μmol·L－1的水杨酸处理使薯蓣皂素积累量最大,且提高了叶绿素含量和可溶性糖含量,降低可溶性蛋白含量。半定量 RT-PCR 检测基因表达发现,除了法尼基二磷酸（FPP）基因,水杨酸增强菊叶薯蓣角鲨烯合酶（SQS）基因、甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGR）基因、环阿屯醇合成酶（CAS）基因的表达。研究结果为提高菊叶薯蓣中薯蓣皂苷的含量、揭示水杨酸促进薯蓣皂素生物合成的机制等研究提供了基础。     

薯蓣皂素对小麦幼苗抗旱性的影响

用不同浓度的薯蓣皂素喷施处理小麦幼苗叶片,研究薯蓣皂素在干旱胁迫下对小麦幼苗影响。结果表明,喷施一定浓度的外源薯蓣皂素,在干旱胁迫下可保持小麦幼苗叶片相对含水量,提高SOD和POD活性,降低MDA含量,对小麦幼苗抗旱有一定的作用。且薯蓣皂素最佳质量浓度为0.5 mg.L-1。     

超声波辅助处理对发根农杆菌介导的苦豆子遗传转化的影响

以发根农杆菌转化苦豆子的子叶和下胚轴外植体,结果表明,辅助以超声波处理有助于转化率的提高,当超声波(功率120W,震荡频率50kHz)处理25min时,转化率达到最高峰(子叶为83．7％,下胚轴为39．1％),分别高于对照(14．4％和9．8％)69．3％和29．3％。在此条件下,进一步添加AS l00μmol/L,可使转化率再进一步提高9．9％和7．6％。     

不同理化因子对黄芩毛状根诱导的影响

目的:利用发根农杆菌1.2556诱导黄芩,得到毛状根.方法:采用共培养法诱导黄芩毛状根,研究不同外植体,不同预培养时间,不同菌液浓度,不同感染时间,乙酰丁香酮,抗生素浓度等条件对转化率的影响.结果:利用预培养2d后的茎段为转化材料,当发根农杆菌浓度在OD600值为0.5时感染10min,转化率最高.在菌液中或培养基中添加100umol/L,乙酰丁香酮可以提高黄芩毛状根的转化效率.培养基中加入250mg/L抗生素Cef能较好地抑制发根农杆菌生长.结论:用共培养法诱导出黄芩毛状根,并确定了最佳诱导条件,以提高黄芩外植体的诱导率.     

盾叶薯蓣内生真菌及其对宿主培养物生长和皂苷元生产的影响

从盾叶薯蓣根状茎中分离并鉴定了9株内生真菌,经悬浮培养14d,分别制备灭活菌丝和菌液浓缩物。其中,内生尖孢镰刀菌Dzf17能有效地提高盾叶薯蓣无菌苗和培养细胞薯蓣皂苷元的含量和产率,且灭活菌丝的诱导效果要强于菌液浓缩物。Dzf17灭活菌丝处理无菌苗,薯蓣皂苷元的产率为78.697mg/L,是对照(27.471mg/L)的2.865倍;用Dzf17菌液浓缩物处理无菌苗,皂苷元产率为41.822mg/L,是对照的1.522倍。Dzf17灭活菌丝处理培养细胞,薯蓣皂苷元的产率为1.391mg/L,是对照(0.691mg/L)的2.013倍;用Dzf17菌液浓缩物处理培养细胞,皂苷元产率为1.214mg/L,是对照的1.757倍。结果表明,在盾叶薯蓣无菌苗或细胞培养中添加一定量的内生真菌灭活菌丝或菌液浓缩物对于提高薯蓣皂苷元含量和产量将是一种有效的方法。     

红光对五彩苏茎段发根及内源ABA含量的影响

分别以红光（６６０ｎｍ）和远红光（７８０ｎｍ）照射五彩苏茎段,诱导茎段发根,并以免疫法测定五彩苏茎段内源ＡＢＡ含量。结果表明,红光诱导茎段发根而远红光无效;内源ＡＢＡ的含量在全茎段、特别在茎下半段用远红光较红光处理的高。以红光照射黄瓜苗可提高根冠比,进一步证明了红光促进发根的效应。     

不同理化因子对发根农杆菌Ri质粒转化骆驼刺的影响

骆驼刺苗茎切段有很强的离体培养再生能力,用野生型发根农杆菌Ａ,菌株转化骆驼刺度轩茎段,并建立了发根转化体的培养体系。高压纸电泳显示转化组织可合成冠瘿。试验不同试验经条件及理化因子对提高转化率和加快发根生长的影响。结果表明,经过３天预培养及０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇１２ｈ高渗处理后培养于ＭＳ培养基中可有效提高转化率。而２％～３％蔗糖,３ｍｇ／Ｌ,ＧＡ３,１０μｍｏｌ／ＬＣｕ＾２＋,１０ｍｇ／ＬＡｇ＾＋,     

寡糖素对丹参发根发生和丹参酮合成的影响

从不同来源的真菌材料中制备诱导子,用它们刺激丹参发根,分别研究了不同浓度的串珠镰孢菌寡糖素对发根生长和不同的酵母诱导物对总丹参酮合成的影响。结果表明,除酵母提取液的酒精沉淀物以外,所有的真菌诱导物普遍引起丹参发根根尖不同程度地膨大。另外串珠镰孢菌寡糖素能显著促进发根生长,其中以50ms／L的诱导浓度效果最明显,与对照相比。丹参发根生物量增加了50．46％;酵母诱导物不同程度地促进发根丹参酮的合成,其中以商品酵母粉酒精沉淀物作用最强,确定酵母诱导物对丹参发根的主要有效成分是低聚糖。     

镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响

研究了镰刀菌(Fusarium solani)诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响。结果表明:当培养基中诱导子糖含量达到30 mg GE/L时能使薯蓣皂素的含量明显提高;薯蓣皂素含量的最大值出现在镰刀菌诱导子处理后的第35 d,达到对照的2倍左右;盾叶薯蓣离体培养物PPO、SOD活性以及可溶性蛋白含量在添加诱导子后呈现一定的规律性变化。     

Ri T-DNA对盾叶薯蓣的遗传转化及薯蓣皂甙元产生的影响

利用农杆菌介导法成功地将Pd T-DNA转入药用植物盾叶薯蓣,产生了毛状根,经分子信标探针检测农杆菌Pd质粒上的T-DNA已整合进植物基因组中。研究建立了毛状根大量快速繁殖技术,基本技术要求为：1／2 MS液体培养基,28℃培养温度,350lux弱光条件下有利于毛状根的增殖培养,提高生物量。HPLC测定结果显示,转基因获得的毛状根其薯蓣皂甙元的含量分别是微块茎、愈伤组织和植物体合成量的5．68倍、6．12倍和2．68倍。     

发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系的建立

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的建立对植物功能基因的验证具有重要意义,为了在桉树（Eucalyptus）中建立发根农杆菌介导的遗传转化体系,本研究以不同的发根农杆菌菌株侵染尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）的叶片和茎段,确定合适的农杆菌菌株和外植体类型,在此基础上开展农杆菌浓度、侵染时间对毛状根诱导的影响。结果表明：采用发根农杆菌菌株MSU440,以叶片为外植体进行发根诱导,最高获得了81.0%的毛状根诱导率,毛状根平均根长达到3.23 cm。在发根农杆菌浓度为OD₆₀₀=0.3、侵染时间为30 min时,共培养48 h后经过20 mg·L^-1卡那霉素筛选培养,通过PCR分子鉴定和GUS染色证实外源基因稳定地整合在桉树毛状根基因组中,转化率达20.2%。初步建立了发根农杆菌介导的桉树遗传转化体系,为桉树基因功能鉴定和进一步的转基因育种奠定基础。     

Transformation of Gynostermma pentaphyllum by Agrobacterium rhizogenes and Saponin Production in Hairy Root Cultures

Authors report here the establishment of an efficient transformation system for Gynosternrna pentaphyllum (Thunb.) Makino using Agrobacteriurn rhizogenes R1600. Hairy roots appeared on leaf explants 10 days after inoculation with the bacteria . Frequency of the explants transformed by R1600 was up to 94%. Transformation was confirmed by Southern analysis. Biomass of hairy root cultures suspended in hormone-free MS medium increased 9 times after 20 days of incubation. There was no callus formation on the hairy roots during suspension culture. Saponin content in the hairy root cultures was about 2 times as much as in the natural roots, saponins of the hairy root cultures were also released into growth medium as well.     

胡杨组织培养叶片及插穗毛状根发生

胡杨(Populus euphratica)是唯一分布在干旱沙漠地区的高大乔木, 根蘖能力强, 但自然条件下插穗难以生根, 扦插繁殖困难。该文研究发根农杆菌菌株ATCC11325诱导胡杨发根, 菌液浓度为OD₆₀₀=0.4, 添加100 mg·L^-1乙酰丁香酮, 叶片切段划伤预培养后侵染10分钟, 培养20天, 在叶片创伤部位诱导发生无向性的健壮毛状根; 浸染肉质根插穗, 须根发生和植株成活率从20%提高到60%, 且地上部分分枝多, 生长茂盛。该发根农杆菌菌株显著促进胡杨插穗生根成活。     

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。     

利用CRISPR/Cas9双基因敲除系统初步解析大豆GmSnRK1.1和GmSnRK1.2对ABA及碱胁迫的响应

蔗糖非发酵相关激酶(sucrose non-fermenting related protein kinases, SnRKs)是广泛存在于植物中的一类Ser/Thr蛋白激酶,在植物的生长、发育、代谢和抗逆等方面具有重要调节作用。大豆(Glycine max L.)基因组中含有4个SnRK1同源基因,其中GmSnRK1.1和GmSnRK1.2为两个主要表达基因,可能参与大豆多种抗逆途径。为解析大豆GmSnRK1.1和GmSnRK1.2对ABA及碱胁迫的响应,本研究构建了双靶点CRISPR载体定向敲除GmSnRK1.1和GmSnRK1.2基因,利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导大豆遗传转化,获得双基因敲除突变体毛状根,经测序鉴定双基因突变率为48.6%;同时,利用实验室前期构建的植物超量表达载体获得超量表达GmSnRK1基因大豆毛状根。经25 μmol/L ABA处理15 d,对照组和超量表达毛状根的生长受到明显抑制,其根长与根鲜重均显著低于双基因敲除突变体毛状根;经50 mmol/L NaHCO₃处理15 d,对照组和双基因敲除突变体毛状根的生长受到明显抑制,其根长与根鲜重均显著低于超量表达毛状根。本研究建立的CRISPR/Cas9系统能够有效地对大豆进行GmSnRK1.1和GmSnRK1.2双基因敲除,基因敲除突变降低了植物对ABA的敏感性及对碱胁迫的耐性,研究结果初步说明SnRK1激酶在植物响应非生物胁迫中具有重要作用。     

3种农杆菌对茶树发状根诱导的影响

以茶树‘福云6号’和‘铁观音’成熟种子下胚轴、未成熟种子下胚轴和愈伤组织为材料,以发状根诱导率为指标,探究菌液浓度、农杆菌菌株、外植体类型和预培养时间对发状根诱导的影响。结果表明:(1)菌液浓度OD600在0.4~1.2范围内,‘福云6号’成熟种子下胚轴发状根诱导率先升高后降低,ATCC15834在OD600为0.6时发状根诱导率最高为23.96%,A4和K599在OD600为0.8时,发状根诱导率最高,分别为10.51%和13.11%。(2)3种发根农杆菌致根能力不同,ATCC15834侵染力最强,致根能力大小依次为ATCC15834>K599>A4。(3)发状根诱导率与外植体有关,茶树成熟种子下胚轴可被诱导产生发状根,诱导率‘福云6号’大于‘铁观音’,未成熟种子下胚轴和愈伤组织难以产生发状根。(4)不经预培养和预培养时间为1~2 d的愈伤组织易褐变,无法产生发状根;预培养3 d的愈伤组织经侵染可产生发状根,诱导率为1.85%(‘福云6号’)和0.59%(‘铁观音’)。(5)PCR琼脂糖凝胶电泳检测和GUS组织化学染色证实GUS基因已被整合进‘福云6号’和‘铁观音’愈伤组织和成熟种子下胚轴发状根基因组中并表达。研究发现,发根农杆菌ATCC15834在OD600为0.6时,对茶树‘福云6号’成熟种子下胚轴发状根诱导率最高。该研究结果对改进发根农杆菌介导的茶树遗传转化系统提供理论依据,对茶树高效遗传转化体系的优化和新型受体的开发具有重要意义。     

新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立

利用发根农杆菌R1601、R1000、LBA9402感染新疆雪莲的叶片、叶柄和根段外植体,诱导产生毛状根。毛状根接种量为2.8 g/L(FW)时,20d生长量可达66.7 g/L,黄酮含量达到干重的10.23%。冠瘿碱的检测和rolB基因的PCR分析表明,Ri质粒中的T_DNA片段已经整合到毛状根细胞的基因组中。预培养时间、外植体类型以及发根农杆菌的菌株属性对毛状根诱导有着重要的影响。其中预培养2 d的新疆雪莲根段外植体,经过R1601感染后,毛状根的诱导率可达100%。诱导产生的毛状根在附加生长素的液体培养基中,有少量愈伤组织产生。由毛状根再生的植株与雪莲外植体再生的植株在形态上无明显区别,但前者的黄酮含量仅为后者的53%。     

农杆菌转化的小冠花发状根的诱导及其植株再生

利用野生型发根农杆菌15834菌株感染小冠花15日龄无菌苗子叶和下胚轴切段,建立了高效的发状根培养及其体细胞胚胎发生再生体系。发状根可直接从受伤的外植体表面产生,也能在外植体诱导的愈伤组织上发生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上,转化根能自主生长,表现出典型的发根特征。用适宜浓度的乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液2h,感染预培养2d的子叶获得了最高的转化频率(87.4%)。在附加0.2mgL2,4_D,0.5mgLNAA和0.5mgLKT的MS培养基上,发状根能100%形成胚性愈伤组织,并于含0.5mgLKT,0.2mgLIBA和300mgL脯氨酸的MS培养基上顺序经过体细胞胚胎发育的各个典型时期,转换成完整植株。再生植株除具有发达的侧根外,其它形态特征与未转化植株未见明显的差异,但在获得的5个转化克隆中,其中1个的发状根及其再生植株叶片中有毒物质3_硝基丙酸的含量显著下降,分别为未转化对照的57.68%和58.17%。冠瘿碱纸电泳检测和rolB基因PCR扩增检测均证明农杆菌Ri质粒上的T_DNA已经整合到小冠花转化细胞的基因组中。     

Genetic transformation<Emphasis Type="Italic"> of Pueraria phaseoloides </Emphasis>with<Emphasis Type="Italic"> Agrobacterium rhizogenes</Emphasis> and puerarin production in hairy roots

An efficient transformation system for the medicinal plant Pueraria phaseoloides was established by using agropine-type Agrobacterium rhizogenes ATCC15834. Hairy roots could be obtained directly from the cut edges of petioles of leaf explants or via callus 10 days after inoculation with the bacteria. The highest frequency of explant transformation by A. rhizogenes ATCC15834 was about 70% after infection for 30 days. Hairy roots could grow rapidly on solid, growth regulator-free Murashige and Skoog medium and had characteristics of transformed roots such as fast growth and high lateral branching. Paper electrophoresis revealed that bacteria-free hairy roots of P. phaseoloides could synthesize agropine and mannopine. The polymerase chain reaction amplification of rooting locus genes showed that left-hand transferred DNA of the root inducing plasmid of A. rhizogenes was inserted into the genome of transformed P. phaseoloides hairy roots. The content of puerarin in hairy roots reached a level of 1.190 mg/g dry weight and was 1.067 times the content in the roots of untransformed plants.