盾叶薯蓣环阿屯醇合酶基因克隆与表达

利用巢式PCR和RACE技术从盾叶薯蓣中克隆了阿屯醇合酶的cDNA(定名为DZCAS).结果表明,该cDNA的开放读码框为2 280 bp,编码759个氨基酸的多肽,分子量为86 924 Da,等电点为6.39.氨基酸序列比对表明盾叶薯蓣阿屯醇合酶与其他植物阿屯醇合酶的相似性超过70%,含有环阿屯醇合酶共有的保守序列.利用氧化鲨烯环化酶基因缺陷型酵母表达DZCAS,并用高效液相色谱和液质联用仪检测酵母细胞中环阿屯醇合成情况,证明DZCAS编码环阿屯醇合酶.RT-PCR分析表明,DZCAS在盾叶薯蓣幼叶中表达量最高,其次是在地下幼嫩块茎中,而地上幼茎表达量最低.     

水杨酸对菊叶薯蓣中薯蓣皂素生物合成的影响

薯蓣皂素为甾体激素药物合成起始原料,主要来源于菊叶薯蓣等薯蓣属植物的块茎或根状茎,因而关于提高菊叶薯蓣中薯蓣皂素含量的研究有重要意义。利用水杨酸处理菊叶薯蓣的离体植株,研究其对薯蓣皂素生物合成的影响及作用机制。100μmol·L－1的水杨酸处理使薯蓣皂素积累量最大,且提高了叶绿素含量和可溶性糖含量,降低可溶性蛋白含量。半定量 RT-PCR 检测基因表达发现,除了法尼基二磷酸（FPP）基因,水杨酸增强菊叶薯蓣角鲨烯合酶（SQS）基因、甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGR）基因、环阿屯醇合成酶（CAS）基因的表达。研究结果为提高菊叶薯蓣中薯蓣皂苷的含量、揭示水杨酸促进薯蓣皂素生物合成的机制等研究提供了基础。     

盾叶薯蓣环阿屯醇合酶全长基因的克隆与分析

环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)是薯蓣皂甙元生物合成途径中的第一个关键酶.以基因组DNA为模板,利用染色体步行和长距离PCR方法首次克隆了盾叶薯蓣CAS全长基因.序列分析比较结果表明,盾叶薯蓣CAS全长基因为7 192 bp,由18个外显子和17个内含子组成.外显子总长为2 280 bp,编码759个氨基酸,最长的外显子为198 bp,最短的为47 bp;内含子总长4 912 bp,最长的内含子为1 551 bp,最短的为68 bp.Southern blot杂交分析表明,CAS基因在盾叶薯蓣基因组中为单拷贝.     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

滇牡丹环阿屯醇合成酶基因的克隆及表达分析

为研究环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase)基因在滇牡丹生物合成中的作用机制,该文采用RTPCR技术首次从滇牡丹(Paeonia delavayi)中克隆得到一个具完整开放阅读框的环阿屯醇合成酶基因(PdCAS),该基因全长2 274 bp,共编码757个氨基酸,PdCAS蛋白序列与桃(Prunus persica)、日本裸樱(Prunus yedoensis var. nudiflora)、葡萄(Vitis vinifera)蛋白序列相似性在86%以上。序列比对分析显示PdCAS具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和三萜合成酶的标志性序列DGSWYGSWGVCFTYG。滇牡丹PdCAS蛋白与蔷薇科植物苹果(Malus domestica XP 008391430.1)、白梨(Pyrus bretschneideri XP 009370034.1)、月季(Rosa chinensis XP 024193310.1)、日本裸樱(Prunus yedoensis var. nudiflora PQQ11009.1)、桃(Prunus persica XP007225240.1)的CAS蛋白聚为一类。PdCAS基因在滇牡丹各组织中均有表达,但是在花瓣中表达量较高。该研究克隆的PdCAS基因与滇牡丹甾醇类化合物的合成密切相关。     

罗汉果环阿屯醇合酶的同源建模、分子对接及催化环化的机理推测

环阿屯醇为植物甾醇类化合物,也是诸多甾醇类化合物生物合成的关键前体物质之一,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节胆固醇等多种药理活性。课题组前期克隆了罗汉果环阿屯醇合酶基因(Cycloartenol Synthase,CAS)并对其进行了功能验证(GenBank登录号:HQ128566)。但该酶的催化活性位点及催化机制尚不明确,阻碍了进一步的改造及应用。本研究利用同源建模预测CAS的三维结构,结合分子对接模拟技术分析该酶与底物的相互作用,结果表明,Asp491、Cys492、Cys570、Tyr540、His265是CAS酶上关键的催化位点,Asp491质子化2,3-氧化鲨烯引发四个环化反应形成C20正离子中间体,然后中间体经过一系列的碳正离子重排形成C11正离子中间体,最后通过His265与Tyr540去质子化使得C27与C11原子间形成单键生成产物环阿屯醇。此外,活性空腔内存在大量的疏水氨基酸,则通过疏水作用稳定反应物、中间体结合在活性空腔。该酶活性位点的发现,为今后通过定点突变技术改造酶的活性及调控代谢通路奠定了基础。     

生物合成薯蓣皂素的途径设计及关键酶分析

薯蓣皂素是一种天然甾体皂苷元,可作为数百种类固醇药物的前体,具有重要药用价值。目前工业生产薯蓣皂素主要依赖化学提取法,因此该法依赖植物材料和耕地且对环境有害。随着代谢工程和合成生物学的发展,生物合成法受到广泛关注。文中综述了生物合成薯蓣皂素的代谢途径和关键酶,并在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中设计其异源合成途径,提出改造策略,以期为全生物合成薯蓣皂素提供有价值的参考。     

桃ACC合酶基因的分离及其差异表达

利用5′/3′RACE PCR技术,从桃(Prunus persica (L.) Batsch)果实中克隆了植物乙烯生物合成的关键酶--ACC合酶的全长cDNA pacs,对pacs基因进行全序列测定表明,该基因全长1 848个碱基,编码区为1 449个碱基,5′端有177个碱基的非编码区序列,3′端有219个碱基的非编码区序列(不包括终止密码子TAA).pacs基因编码区共编码483个氨基酸,蛋白质大小为54 kD,等电点为6.43.pacs与番茄(S19677)、梅(AB031026)、番木瓜(U68216)、苹果(AB034993)等其他植物ACC合酶cDNA氨基酸序列同源性分别为65%、70%、75%、90%,并存在与这些ACC合酶氨基酸的活性位点保守序列SLSKDMGFPGFR.RT-PCR结合杂交分析表明,pacs和我们以前克隆的桃ACC合酶cDNA pacs12(AF467782)在叶片和花中基因表达模式基本一致,伤处理和IAA均能诱导叶片pacs 和pacs12基因的表达,但pacs在伤处理叶片的表达水平比pacs12高;pacs 和pacs12基因在果实表达有所不同,pacs在绿熟和成熟果实中均有表达,而pacs12在绿熟果实中基本检测不到,在成熟果实中才有表达,两者在果实中的表达水平比伤处理和IAA处理叶片和花中要低.     

一个新高产青蒿倍半萜合酶基因的克隆、表达和分析

用RACE方法从青蒿(Artemisia annua L.)高产株系001中克隆了一个新的1 886 bp的全长倍半萜合酶cDNA.克隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶、莨菪岩兰螺旋二烯合酶、棉花杜松烯合酶的一致性分别为39%、38%和41%;与青蒿柏木脑合酶、紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆cASC125的一致性为50%、48%和59%.cDNA编码区序列被克隆进原核表达载体pET-30a,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达,但过量表达的蛋白主要是以不溶性蛋白形式存在.Northern blotting分析表明此基因在茎、叶和花中表达,在根中没有表达.     

桃ACC合酶基因的分离及其差异表达

利用5'/3'RACE FCR技术,从桃（Prunus persica(L.)Batsch）果实中克隆了植物乙烯生物合成的关键酶-ACC合酶的全长cDNA pacs,对pacs基因进行全序列测定表明,该基因全长1848个碱基,编码区1449个碱基,5'端有177个碱基的非编码区序列,3'端有219个碱基的非编码区序列（不包括终止密码子TAA）。pacs基因编码区共编码483个氨基酸,蛋白质大小为54kd,等电点为6.43。pacs与番茄（S19677）、梅（AB031026)、番木瓜（U68216）、苹果（AB034993）等其他植物ACC合酶cDNA氨基酸序列同源性分别为65%、70%、90%,并存在与这些ACC合酶氨pacs12(af467782)在叶片和花中基因表达模式基本一致,伤处理和IAA均能诱导叶片pacs和pacs12基因的表达,但pacs在伤处理叶片的表达水平比pacs12高;pacs和pacs12基因在果实表达有所不同,pacs在绿熟和成熟果实中均有表达,而pacs12在绿熟果实中基本检测不同,在成熟果实中才有表达,两在果实中的表达水平比伤处理和IAA处理叶片和花中要低。     

从葫芦巴种子中提取薯蓣皂甙元方法的研究

为探明葫芦巴种子中药用活性成分薯蓣皂甙元提取的最佳方法,设置了不同的酸解液浓度及酸解时间以了解葫芦巴粉酸解的适宜条件;并在酸化工艺前将脱脂的葫芦巴粉进行自然发酵或接种曲霉发酵以提高薯蓣皂甙元的提取率。结果表明葫芦巴粉酸解液最佳浓度为15%的硫酸溶液,最适宜的酸解时间为6 h。在酸化工艺前增加发酵工艺,可以显著提高有效成份薯蓣皂甙元的提取率,接霉菌发酵比直接酸化提高62%,自然发酵比直接酸化提高48%。     

Expression analysis of steroid pathway genes revealed positive correlation with diosgenin biosynthesis in <Emphasis Type="Italic">Trillium govanianum</Emphasis>

Trillium govanianum Wall. ex D. Don, popularly known as Nagchhatri, is an important medicinal plant of northwestern Himalayas. No data exist on molecular characteristics of diosgenin biosynthesis, the main chemical component of T. govanianum. HPLC analysis revealed diosgenin content of 2.4 and 0.7% in hydrolyzed rhizome extracts of Chamba and Lahaul and Spiti, respectively. Quantitative real-time PCR analysis of five genes of steroid pathway in the rhizomes of two locations, differing for diosgenin content showed up to 3.2-fold increase in expression level of genes viz. hydroxymethylglutaryl Co-A reductase (HMGR), farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), squalene synthase (SQS), 26-O-beta-glucosidase (BETA) and cycloartenol synthase (CAS) in rhizomes of Chamba (2.4%) as compared to Lahaul and Spiti (0.7%), thus inferring their role in diosgenin biosynthesis. The present study delivers the first report where an elite chemotype of T. govanianum for diosgenin content was identified and partial sequences of five genes of steroid pathway were cloned and investigated for their potential role in diosgenin biosynthesis in T. govanianum. The result of this study has prospective applications in the genetic improvement of this medicinally important plant species.     

Biotic elicitors enhance diosgenin production in Helicteres isora L. suspension cultures via up-regulation of CAS and HMGR genes

In an attempt to find an alternative and potent source of diosgenin, a steroidal saponin in great demand for its pharmaceutical importance, Helicteres isora suspension cultures were explored for diosgenin extraction. The effect of biotic elicitors on the biosynthesis of diosgenin, in suspension cultures of H. isora was studied. Bacterial as well as fungal elicitors such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger were applied at varying concentrations to investigate their effects on diosgenin content. The HPLC based quantification of the treated samples proved that amongst the biotic elicitors, E. coli (1.5%) proved best with a 9.1-fold increase in diosgenin content over respective control cultures. Further, the scaling-up of the suspension culture to shake-flask and ultimately to bioreactor level were carried out for production of diosgenin. During all the scaling-up stages, diosgenin yield obtained was in the range between 7.91 and 8.64 mg l−1, where diosgenin content was increased with volume of the medium. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis showed biotic elicitors induced the expression levels of regulatory genes in diosgenin biosynthetic pathway, the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGR) and cycloartenol synthase (CAS), which can be positively correlated with elicited diosgenin contents in those cultures. The study holds significance as H. isora represents a cleaner and easy source of diosgenin where unlike other traditional sources, it is not admixed with other steroidal saponins, and the scaled-up levels of diosgenin achieved herein have the potential to be explored commercially.     

Influence of plant matrix on microwave-assisted extraction process. The case of diosgenin extracted from fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.)

A focused microwave-assisted extraction method was developed for the extraction of diosgenin from fenugreek (Trigonella foenum-graecum) seeds, air-dried and fresh leaves and air-dried roots. Several experimental parameters were studied, including extraction time, microwave power applied and percentage of 2-propanol in the extraction mixture as well as their interactions, in order to optimize the extraction efficiency. The two latter parameters were found to be the most important. Response surface modelling was used to predict the extraction yield of diosgenin in selected matrices. The analysis of diosgenin in crude extracts was carried out by capillary gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).     

两种影响因子对葫芦巴发根转化率的影响

葫芦巴（Trigonella foenum-graecum L.）是薯蓣皂素源植物之一,本文以来源于中国山西省的一年生草本植物葫芦巴为实验材料,研究发根农杆菌菌液浓度与超声波辅助处理两个因素对葫芦巴发根转化率的影响。结果显示,随着菌液浓度升高,发根数和发根转化率均逐渐升高,中浓度与低浓度菌液相比,发根数量和转化率分别升高了2.58和3.90倍;利用高浓度菌液侵染获得的发根数量和发根转化率最高,分别是低浓度菌液的7.33和4.32倍。在超声波处理实验中,超声（工作频率40 KHz,超声功率180 W）处理30 s与经未超声处理的对照组相比,发根数量及转化率略有下降;当超声处理60 s时,发根转化率明显上升,为对照组的2.48倍。葫芦巴发根体系的建立可为生产薯蓣皂素以及解析薯蓣皂素合成路径提供一个关键的技术平台。