滇黄芩毛状根的诱导及其黄芩苷含量测定

本文利用发根农杆菌A grobacterizum rhizogenes1.2556感染滇黄芩再生苗的茎段和叶片,建立了毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的茎、叶外植体表面产生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根茎段的诱导率较叶片高,最高可达到14.44%;经rolB基因PCR分析和甘露碱纸电泳检测,证明Ri质粒T-DNA已整合到滇黄芩基因组中并表达;毛状根在附加6-BA2mg/L和NAA0.2mg/L的MS固体培养基上直接诱导不定芽,并在MS培养基上生根,形成再生植株。获得的毛状根系经MS液体培养基培养30d后通过HPLC都能检测到黄芩苷,其中1个转化系黄芩苷含量为2.59%,是药材黄芩的0.20倍,而从3年单位时间黄芩苷生成量计算,毛状根是药材黄芩的7.18倍。本研究建立的毛状根培养体系,将对滇黄芩转基因技术的完善和利用毛状根生产黄芩苷的生物转化提供了实验基础。     

滇黄芩器官发生与不同继代次数遗传稳定性的RAPD分析

本研究以滇黄芩不带腋芽茎段为外植体,采用不同配比激素的MS培养基建立了滇黄芩器官发生,植株再生体系.结果表明,茎段在MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基上培养时,愈伤组织诱导率达到100%:以相同培养基进行分化,并在MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基上扩繁丛生芽.在1/2MS+IBA 0.2 mg/L培养基诱导生根,扦插继代.利用RAPD分析不同继代次数再生植株,所用的39条随机引物中只有1条引物带型发生变化.说明经组织培养获得的再生植株遗传稳定,可多次继代培养,为滇黄芩进一步遗传操作和扩大药材资源奠定基础.     

发根农杆菌对骆驼刺的转化及转化组织的形态发生

将骆驼刺离体再生苗的茎切段经发根农杆菌A4菌株感染后,在含500mg/L头孢霉素的MS无激素培养基上培养,产生了转化的发根和愈伤组织.转化根在附加2mg/L2,4-D和0.5-1mg/L6BA的MS培养基上培养后,亦可诱导出愈伤组织.在含3mg/L6BA和0.5mg/LNAA的培养基上诱导出了苗的分化.冠瘿碱分析表明,在95%以上的发根和75%的转化愈伤组织及再生植株中都显示了T-DNA的整合和表达.染色体检查发现,约81%的发根细胞具有正常染色体数(2n=18),其余则存在染色体数目的变化,在继代培养一年之后,转化体仍维持旺盛的再生能力.     

褪黑素合成酶基因转化烟草及转化植株抗氧化系统变化

通过根癌农杆菌(含植物表达载体YXu55)介导的转化技术,将褪黑素生物合成酶-芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase,AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase,HIOMT)基因导入到烟草(秦烟95)中。对所获得的庆大霉素抗性烟草株系进行Southern blotting和RT-PCR分子生物学检测,结果表明,AANAT-HIOMT基因已成功地整合到烟草基因组中,并且可以在mRNA水平上进行转录。用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定转化株系的褪黑素含量表明,转AANAT-HIOMT基因烟草株系的褪黑素含量均明显高于pZP122(不含AANAT和HIOMT基因的空白质粒)转基因株系和未转基因的对照植株,证明AANAT-HIOMT基因在转基因植株中的表达增强了褪黑素的合成能力。对不同株系抗氧化系统的部分指标进行了测定,并与其亲本对照植株比较,发现AANAT-HIOMT基因在转基因植物中的表达引起超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性增加,谷胱甘肽(GSH)浓度...     

小蔓长春花组织培养快速繁殖中的遗传稳定性

以小蔓长春花茎段为外植体,在含1.5mg·L-1NAA的MS固体培养基上直接生根,多次继代培养、移栽,建立小蔓长春花组织培养快速繁殖体系。利用RAPD技术结合高效液相色谱技术对连续三次继代无菌苗和炼苗后小蔓长春花的遗传稳定性、长春胺含量稳定性进行分析。结果显示,实验选取的20条随机引物共扩增出清晰的46个条带,不同植株扩增获得的条带数目和带型一致,在所检测范围内继代培养和炼苗均未影响小蔓长春花DNA序列。同时HPLC测得相应材料中长春胺含量均在0.12%以上,培养过程中长春胺含量稳定。本实验建立的小蔓长春花组织培养快速繁殖体系遗传稳定、长春胺含量稳定,可用于大量繁殖小蔓长春花无菌植株,为长春胺生产的提供资源。     

滇黄芩再生植株中黄酮类化合物的组织化学定位及黄芩苷的含量测定

应用植物组织化学定位方法,研究了组织培养滇黄芩再生植株中黄酮类化合物的积累分布状态;并且通过HPLC对滇黄芩再生植株中黄芩苷的含量进行测定。结果表明,滇黄芩再生植株黄酮类化合物主要存在于营养器官的表皮和皮层,以及茎、叶腺毛中。同时,测定再生植株中黄芩苷的含量表明,地下部分(根)含量为0.12%;地上部分(茎、叶)含量为0.43%。     

角蒿的离体培养与快速繁殖

1植物名称角蒿（Incarvillea sinensis Lam.）。 2材料类别种子萌发的无菌苗下胚轴和子叶。 3培养条件基本培养基为MS。（1）种子萌发培养基：1/2MS;（2）丛生芽诱导培养基：MS＋6-BA2mg·L-1（单位下同）＋NAA0.2;（3）丛生芽增殖培养基：MS＋     

AtNHX1基因对草木樨状黄芪的转化和耐盐性表达研究

应用RT-PCR技术从100mmol/LNaCl胁迫处理的拟南芥幼中克隆得到编码液泡膜Na /H 逆向转运蛋白的AtNHX1基因cDNA 编码ORF.并在该ORF上游分别插入CaMV 35启动子和TMV RNA5'UTR的Ω片段,而在下游插入NOS polyA构建真核表达盒,进而将该表达盒插入双元植物表达栽体pNT质粒的T-DNA区构建了携带AtNHX1 基因的植物表达载体质粒pNT-AtNHX1.将pNT-AtNHX1 导入农杆菌LBA4404,用农杆菌介导法将AtNHX1 基因导入豆科牧草草木樨状黄芪中,共获得103株Kan抗性再生植株.通过对农杆菌茵液浓度、侵染时间和乙酰丁香酮浓度等影响转化效率的因素进行优化,初步建立了稳定的草木樨状黄芪农杆菌转化体系.经过PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测表明,AtNHX1 基因已被成功整合到草木樨状黄芪基因组中,并且能够正常转录.野生型和转基因株系诱发的愈伤组织进行耐盐生长实验,结果显示相同盐胁迫条件下,转基因愈伤组织的相对生长率显著高于野生型愈伤组织.施加梯度NaCl胁迫后,植株叶片K ,Na 含量和叶片相对电导率测定结果显示,转基因植物叶片比野生型积累更多的Na 和K ,维持较高的K /Na ;转基因株系叶片相对电导率显著低于野生型.上述结果表明,AtNHX1 基因的导入和表达在提高草木樨状黄芪耐盐性的同时减轻了盐胁迫对植物细胞膜的伤害.关键词: AtNHX1 草木樨状黄芪农杆菌遗传转化耐盐性.     

烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探

茄尼醇是合成泛醌类药物的重要中间体.以发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）W.T15834感染烟草叶片诱导产生毛状根,探讨其茄尼醇含量变化.结果显示,获得的毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织.甘露碱检测及PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在烟草（Nicotiana tabacum）毛状根基因组中整合并得到表达.用改进的HPLC法测定烟草毛状根中的茄尼醇含量,其结果为对照根（种子萌发产生的幼苗根）的1.12倍,但仍比废弃烟叶中茄尼醇含量低43.2%.     

不同理化因子对发根农杆菌Ri质粒转化骆驼刺的影响

骆驼刺苗茎切段有很强的离体培养再生能力,用野生型发根农杆菌Ａ,菌株转化骆驼刺度轩茎段,并建立了发根转化体的培养体系。高压纸电泳显示转化组织可合成冠瘿。试验不同试验经条件及理化因子对提高转化率和加快发根生长的影响。结果表明,经过３天预培养及０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇１２ｈ高渗处理后培养于ＭＳ培养基中可有效提高转化率。而２％～３％蔗糖,３ｍｇ／Ｌ,ＧＡ３,１０μｍｏｌ／ＬＣｕ＾２＋,１０ｍｇ／ＬＡｇ＾＋,