发根农杆菌介导的长春花高效转基因体系的建立

以长春花幼叶为外植体建立了发根农杆菌介导的长春花高效遗传转化体系,主要技术环节为：用携带有基因表达载体的发根农杆菌R1000侵染幼嫩叶片,侵染的叶片外植体与发根农杆菌共培养2d,外植体移至除菌培养基除菌培养2～3周,切取外植体上诱导长出的毛状根置于筛选培养基上培养1-2周,最后对筛选出的阳性毛状根无性系进行扩繁。筛选出的阳性毛状根经GUS染色和PCR分子鉴定表明,该方法的发根诱导率和阳性转化率分别为82％±2．49％和100％。该转化方法所获得的毛状根系数量大、质量高、遗传稳定且所需时间短,明显优于现有的长春花遗传转化技术,是长春花遗传转化的高效便捷体系。     

重金属超富集植物东南景天毛状根的诱导

为建立重金属超富集植物东南景天(Sedum alfredii)的毛状根诱导体系,采用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)A4侵染叶片,研究了预培养时间、侵染时间和共培养时间对毛状根诱导率的影响。结果表明,东南景天叶片外植体的预培养时间为48 h、农杆菌侵染时间为6 min、共培养时间为48 h是适宜的毛状根诱导时间,毛状根的诱导率可达85%。PCR检测表明诱导的毛状根中存在rol B基因片段。这是东南景天首次建立用发根农杆菌诱导毛状根体系。     

发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系的建立

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物后可诱导植物产生毛状根。菠菜(Spinacia oleracea)是常见的食用蔬菜, 目前尚未见菠菜毛状根的研究报道。经筛选得到适合诱导菠菜毛状根的发根农杆菌菌株LBA9402, LBA9402侵染菠菜外植体茎后, 毛状根的诱导率最高可达16%。菠菜毛状根呈白色, 具有丰富的根毛, 能在无外源激素的固体培养基上快速增殖生长。通过诱导菠菜毛状根产生愈伤组织并进行分化, 获得了菠菜毛状根的再生植株, 再生率为8%。此外, LBA9402可将含有Ri质粒的T-DNA和携带外源GFP基因的Ti质粒T-DNA共同导入外植体中。PCR检测和荧光显微观察结果显示, rolB及GFP基因在菠菜毛状根基因组中稳定表达, 共转化频率为50%。     

发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系的建立

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物后可诱导植物产生毛状根。菠菜(Spinacia oleracea)是常见的食用蔬菜, 目前尚未见菠菜毛状根的研究报道。经筛选得到适合诱导菠菜毛状根的发根农杆菌菌株LBA9402, LBA9402侵染菠菜外植体茎后, 毛状根的诱导率最高可达16%。菠菜毛状根呈白色, 具有丰富的根毛, 能在无外源激素的固体培养基上快速增殖生长。通过诱导菠菜毛状根产生愈伤组织并进行分化, 获得了菠菜毛状根的再生植株, 再生率为8%。此外, LBA9402可将含有Ri质粒的T-DNA和携带外源GFP基因的Ti质粒T-DNA共同导入外植体中。PCR检测和荧光显微观察结果显示, rolB及GFP基因在菠菜毛状根基因组中稳定表达, 共转化频率为50%。     

银柴胡离体培养与毛状根诱导技术初步研究

以银柴胡茎段为外植体,经消毒获得无菌再生材料后,筛选发根农杆菌介导毛状根诱导产生的最适条件。结果显示：最适的无菌消毒方法为：70%酒精浸5 s,0.1%升汞消毒3 min,获得了银柴胡离体培养材料;以发根农杆菌A4菌株介导的银柴胡毛状根诱导过程中,与叶片和不带腋芽茎段相比,带腋芽茎段为最适转化外植体,用OD600=0.8的菌液侵染茎段15 min,共培养3 d,800 mg/L头孢噻肟钠除菌,其诱导率及诱导密度最高,分别为100%和4.7,为最适诱导条件。研究结果说明在适合条件下,银柴胡带腋芽茎段适于诱导毛状根。     

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的：利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因（SmGGPS1）RNA干扰（RNAi）载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法：根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）中,构建2个含卡那霉素（Kan）和绿色荧光蛋白（GFP）双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果：分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论：首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。     

何首乌毛状根的诱导和培养(简报)

发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）侵染后,通过其Ri质粒的T－DNA片段在植物细胞基因组中整合,诱导形成毛状根（hairyroot）l’l。利用生长迅速、生产效能高而稳定的毛状根培养物生产药用植物的次生物质,已有不少报道「一习。但未见发根农杆菌对何首乌遗传转化的报道。何首乌（Polygonu。。ltij7orumThunb．）为常用中药,其块根为乌须发、悦颜色、益精养血和抗衰老的要药。本文报道发根农杆菌对何首乌遗传转化的实验结果,为今后用毛状根培养物生产何首乌的次生物质打下基础。l材料和方法细菌菌株及培养发根农杆菌（Agrobacteri…     

外植体龄和蔗糖浓度对黄瓜子叶产生毛状根的影响

研究了外植体龄和蔗糖浓度对发根农杆菌 R160 1介导黄瓜子叶产生毛状根的影响。结果表明 :以 10 d龄子叶外植体产生毛状根的能力最强 ,外植体的毛状根诱导率为 88.89% ;2 0 d龄子叶外植体的毛状根诱导率比 10 d龄子叶外植体降低 52 .86% ;30 d龄子叶外植体感染发根农杆菌R160 1后不产生毛状根。感染发根农杆菌 R160 1的黄瓜子叶外植体在不加或加 1%蔗糖的 MS培养基上的毛状根诱导率极低 ,子叶外植体逐渐变黄 ,腐烂 ;而培养基中添加 2 % ,3%或 4 %的蔗糖可显著提高子叶外植体的毛状根诱导率。黄瓜毛状根能在无外源植物激素的 MS液体培养基中自主生长。冠瘿碱的高压纸电泳检测表明毛状根已被 Ri T- DNA转化     

4种发根农杆菌对朱砂根组培无菌叶片毛状根诱导的影响

以朱砂根(Ardisia crenata Sims)组培无菌叶片为材料,用4种发根农杆菌菌株(A4、ATCC15834、LBA9402和R1601)分别侵染进行毛状根诱导,比较朱砂根叶片毛状根诱导的最适培养基种类、预培养时间、侵染方式、共培养时间以及不同发根农杆菌的致根能力。研究表明:(1)朱砂根无菌叶片毛状根诱导最适培养基为1/2MS培养基,预培养2d、共培养2d,毛状根诱导率最高(31.87%)。(2)最佳侵染方式以剪好的幼叶和活化好的菌液(100mg/L AS)一起在28℃、180r/min黑暗条件下共振荡8~15min。(3)4种发根农杆菌均能诱导朱砂根叶片毛状根产生,但A4、ATCC15834效果最好,其致根能力大小顺序依次为ATCC15834A4LBA9402R1601。(4)PCR分子鉴定表明,发根农杆菌Ri质粒T-DNA已成功整合到宿主细胞核基因组中。     

胡杨组织培养叶片及插穗毛状根发生

胡杨(Populus euphratica)是唯一分布在干旱沙漠地区的高大乔木, 根蘖能力强, 但自然条件下插穗难以生根, 扦插繁殖困难。该文研究发根农杆菌菌株ATCC11325诱导胡杨发根, 菌液浓度为OD₆₀₀=0.4, 添加100 mg·L^-1乙酰丁香酮, 叶片切段划伤预培养后侵染10分钟, 培养20天, 在叶片创伤部位诱导发生无向性的健壮毛状根; 浸染肉质根插穗, 须根发生和植株成活率从20%提高到60%, 且地上部分分枝多, 生长茂盛。该发根农杆菌菌株显著促进胡杨插穗生根成活。     

喜树毛状根的诱导及其喜树碱含量分析

研究了不同外植体类型(包括真叶、茎段、子叶及胚轴)、胚轴年龄和不同发根农杆菌菌株(包括A4、15834、R1601、C58C1)等因素对喜树毛状根诱导频率的影响,并用PCR对诱导出的毛状根进行了分子鉴定.结果表明:(1)最佳外植体为胚轴,5~10 d是胚轴最佳诱导年龄段,最佳诱导菌株为15834.(2)PCR鉴定结果表明,发根农杆菌的rolB基因已整合到喜树毛状根基因组中.(3)对不同菌株诱导的毛状根进行HPLC检测表明,C58C1菌株诱导的毛状根的喜树碱和羟基喜树碱含量最高,分别为1.219 mg/g和0.305 mg/g.研究结果为喜树碱的药源开发提供了一条新途径,并为进一步利用基因工程技术调控喜树碱的代谢合成奠定了基础.     

农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系的建立

以刺芹侧耳菌丝球为受体,潮霉素（Hyg）为筛选标记,应用农杆菌介导法对刺芹侧耳菌丝进行了遗传转化研究。潮霉素敏感性测试结果表明,刺芹侧耳Hyg耐受浓度为50mg/L。农杆菌介导的刺芹侧耳菌丝最佳遗传转化体系为：菌液浓度OD₆₀₀=0.6-0.7,侵染时间30-35min,共培养时间2d,侵染液和共培养培养基中乙酰丁香酮（AS）浓度为1mg/mL;经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和GUS活性的组织化学分析,表明外源基因GUS已转入到刺芹侧耳菌丝中,并获得表达。本实验成功地建立了稳定的农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系。     

商陆毛状根的诱导、培养及其扼甙的产生

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）R1601感染商陆叶片外植体1周后,在其切口处产生毛状根,20d后产生毛状根的外植体比例达70%,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生,毛状根能在无激素的MS培养基上自主生长,其呼吸速率比对照根提高85.6%,冠瘿碱检测和PCR扩增结果表明,发根农杆菌RiT-DNA的冠瘿碱合成酶基因及其Ri质粒的rol基因均已在商陆毛状根基因组中得到表达。毛状根中总皂甙含量约为自然根的1.54倍,但其多糖含量则仅为非转化根的70%。     

香石竹毛状根诱导、离体培养及其植株再生

为了探讨利用发根农杆菌遗传转化所产生的毛状根来创新香石竹种质的可能性,本文采用叶盘法,建立了发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes对香石竹Dianthus caryophyllus L.叶片外植体的遗传转化及其植株再生体系。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染香石竹幼嫩叶片外植体12 d后,从叶片外植体切口中脉处产生白色毛状根,21 d后约90%的叶片外植体产生毛状根。所获得的无菌毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基中快速自主生长。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在香石竹毛状根基因组中整合并得到表达。将毛状根置于MS+6-BA 1.0-3.0 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L中培养15 d后产生淡黄绿色的疏松愈伤组织。愈伤组织不定芽分化的最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L,培养6周后不定芽分化率为100%;平均每个愈伤组织产生30-40个不定芽;将不定芽转至1/2 MS或1/2 MS+0.5 mg/L NAA的培养基中10 d后产生不定根,发育成再生植株。再生植株移植于栽培基质中20 d后,成活率达95%以上。     

不同理化因子对黄芩毛状根诱导的影响

目的:利用发根农杆菌1.2556诱导黄芩,得到毛状根.方法:采用共培养法诱导黄芩毛状根,研究不同外植体,不同预培养时间,不同菌液浓度,不同感染时间,乙酰丁香酮,抗生素浓度等条件对转化率的影响.结果:利用预培养2d后的茎段为转化材料,当发根农杆菌浓度在OD600值为0.5时感染10min,转化率最高.在菌液中或培养基中添加100umol/L,乙酰丁香酮可以提高黄芩毛状根的转化效率.培养基中加入250mg/L抗生素Cef能较好地抑制发根农杆菌生长.结论:用共培养法诱导出黄芩毛状根,并确定了最佳诱导条件,以提高黄芩外植体的诱导率.     

少花龙葵毛状根的诱导和次生代谢物的产生

研究了发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)对少花龙葵（Solanum photeinocarpum)的转化和毛状根的诱导,分析了影响转化的因素,并初步检测了毛状根的生长和次生代谢物的产生。发根农杆菌菌株R1000、R1601分别感染少花龙葵的叶片、茎段,约7d后得到毛状根。菌株R1000感染的外植体的生根率分别为90．2％和50．0％,根诱导频率分别为6．2和4．6;菌体R1601感染的外植体的生根率分别为92．1％和49．2％,根诱导频率分别为6和5．5;对照两周内不出根。冠瘿碱检测证实所得毛状根为转化根。感染在MS＋PP333培养基上生长的矮壮苗叶片,毛状根诱导频率显著提高;用MS液体培养基稀释1倍的菌液感染叶片,转化效率也得到提高。毛状根生长速度快,培养4周后干重增加420倍,总糖苷生物碱和皂甙含量分别为原植株根的31和107倍。     

商陆毛状根的诱导、培养及其皂甙的产生

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）R1601 感染商陆叶片外植体1周后,在其切口处产生毛状根,20d后产生毛状根的外植体比例达70%;毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。毛状根能在无激素的 MS培养基上自主生长,其呼吸速率比对照根提高85.6%。冠瘿碱检测和PCR扩增结果表明,发根农杆菌RiTDNA的冠瘿碱合成酶基因及其Ri质粒的rol 基因均已在商陆毛状根基因组中得到表达。毛状根中总皂甙含量约为自然根的154倍,但其多糖含量则仅为非转化根的70%。     

新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立

利用发根农杆菌R1601、R1000、LBA9402感染新疆雪莲的叶片、叶柄和根段外植体,诱导产生毛状根。毛状根接种量为2.8 g/L(FW)时,20d生长量可达66.7 g/L,黄酮含量达到干重的10.23%。冠瘿碱的检测和rolB基因的PCR分析表明,Ri质粒中的T_DNA片段已经整合到毛状根细胞的基因组中。预培养时间、外植体类型以及发根农杆菌的菌株属性对毛状根诱导有着重要的影响。其中预培养2 d的新疆雪莲根段外植体,经过R1601感染后,毛状根的诱导率可达100%。诱导产生的毛状根在附加生长素的液体培养基中,有少量愈伤组织产生。由毛状根再生的植株与雪莲外植体再生的植株在形态上无明显区别,但前者的黄酮含量仅为后者的53%。     

胡萝卜毛状根的诱导及条件优化

以发根农杆菌A4、LBA9402、R1000为实验菌株,从胡萝卜中成功诱导出可在无激素条件下快速生长的毛状根,通过PCR方法对其进行了初步鉴定.该毛状根在MSR培养基上生长迅速,1个月左右即可长满整个平板,并经多次继代后仍保持其特性.研究了菌株类型、培养基、菌液量、菌液浓度和共培养天数对胡萝卜毛状根转化频率的影响,筛选出的较优胡萝卜发根条件为:使用A4发根农杆菌菌株,共培养培养基为添加50 mg/L Vitamin C(Vc)的水琼脂,加菌量20 μL,侵染液OD600值0.6,共培养天数2 d.胡萝卜毛状根诱导体系的建立和条件优化为其他植物毛状根的诱导提供了技术参考,同时为进一步研究胡萝卜的次生代谢及建立菌根共生体系等奠定了基础.     

影响虎杖毛状根高频诱导的因素探讨

利用发根农杆菌ATCC15834对虎杖（Reynoutria japonica Houtt．）进行遗传转化,探讨影响其毛状根高频诱导的因素。结果表明：成熟叶片是转化效率较高的外植体,感染10d左右可形成毛状根,平均诱导率为55．66％,诱根密度为4．30。经PCR检测．证实农杆菌Ri质粒中的rolB及tms基因全部转入毛状根中。改良YEB培养液活化菌种后对出根作用小显著;叶片未经预培养而直接进行感染,其出根效果要明显好于经过MS。或利用TDZ预培养处理（P〈0．01）．毛状根平均诱导牢可达到81．84％,诱根密度为7．04;稀释菌液浸泡、超声振荡或微波辐射处理均可促使叶片提前出根．其中以超声处理30s效果最显著（P〈0．01）;感染叶片上表皮向上放置进行共培养有利于毛状根形成。在优化各种转化条件后,虎杖毛状根平均诱导率可提高到97．1％,诱根密度达到11．3。