植物生长物质对白英毛状根生长及薯蓣皂苷元含量的影响

利用含p Ri A4质粒的农杆菌C58C1浸染白英叶片获得能在无植物生长物质培养基上自主生长的毛状根单克隆系,且毛状根中薯蓣皂苷元含量高于野生型白英植株。在液体培养基中添加不同浓度的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)或6-BA与NAA的结合处理白英毛状根,观察其对毛状根生长的影响,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定毛状根中薯蓣皂苷元含量。结果表明,6-BA抑制白英毛状根的生长,且随6-BA浓度增加,抑制作用越明显,6-BA能增加白英毛状根每克干物质中薯蓣皂苷元的含量,但降低培养瓶中毛状根薯蓣皂苷元总量。NAA对毛状根的生长有促进作用,其中,经0.5 mg·L-1NAA处理的毛状根在培养30 d时干重达到同期对照的1.76倍。虽然NAA降低每克干物质中薯蓣皂苷元含量,但提高培养瓶中毛状根薯蓣皂苷元总量,薯蓣皂苷元总量最高可达0.97 mg(DW)·瓶-1,是对照整个培养过程中最大值的1.37倍。6-BA与0.5 mg·L-1 NAA的结合抑制白英毛状根的生长,同时降低每克干物质中薯蓣皂苷元的含量。     

何首乌毛状根培养及其活性成分的产生

利用发根农杆菌LBA940 2诱导药用植物何首乌产生毛状根。PCR扩增和Southern印迹杂交实验证实发根农杆菌中Ri质粒的T-DNA片段已整合进入植物核基因组中。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察 ,确立了何首乌毛状根在MS培养基中的最佳继代时间为 30d左右。HPLC实验测定结果显示 ,毛状根培养物中大黄酸的含量是原植物的 2 85倍     

木豆毛状根的诱导及其培养条件的研究

利用发根农杆菌LBA9402对木豆叶片直接进行诱导产生毛状根。本实验研究出诱导木豆毛状根的最佳条件是,以木豆叶片为外植体,于1/2MS固体培养基上预培养2~4 d,菌液浓度OD₆₀₀=0.6~0.8,浸染20 min,共培养3 d,诱导率为60.00%。在分子水平用PCR检测表明,发根农杆菌9402Ri质粒上的T-DNA成功整合进木豆毛状根的基因组中。     

少花龙葵毛状根的诱导和次生代谢物的产生

研究了发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)对少花龙葵（Solanum photeinocarpum)的转化和毛状根的诱导,分析了影响转化的因素,并初步检测了毛状根的生长和次生代谢物的产生。发根农杆菌菌株R1000、R1601分别感染少花龙葵的叶片、茎段,约7d后得到毛状根。菌株R1000感染的外植体的生根率分别为90．2％和50．0％,根诱导频率分别为6．2和4．6;菌体R1601感染的外植体的生根率分别为92．1％和49．2％,根诱导频率分别为6和5．5;对照两周内不出根。冠瘿碱检测证实所得毛状根为转化根。感染在MS＋PP333培养基上生长的矮壮苗叶片,毛状根诱导频率显著提高;用MS液体培养基稀释1倍的菌液感染叶片,转化效率也得到提高。毛状根生长速度快,培养4周后干重增加420倍,总糖苷生物碱和皂甙含量分别为原植株根的31和107倍。     

发根农杆菌介导药用甘薯西蒙1号的遗传转化

用发根农杆菌A4分别感染药用甘薯西蒙1号的叶片、茎切段、叶柄等外植体,诱导出毛状根,并对毛状根进行了离体培养.采用L9(34)正交设计法优化甘薯西蒙1号的毛状根诱导条件;PCR扩增检测转化毛状根;用高效液相色谱仪检测了毛状根中咖啡酸的含量.结果表明:转化中茎切段是最合适的外植体,最佳感染时间20 min,共培养最佳时间为2天;PCR扩增检测表明发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进植物的基因组中;经高效液相色谱仪证实毛状根中含有咖啡酸,含量为0.03792 mg/g.     

4种发根农杆菌对朱砂根组培无菌叶片毛状根诱导的影响

以朱砂根(Ardisia crenata Sims)组培无菌叶片为材料,用4种发根农杆菌菌株(A4、ATCC15834、LBA9402和R1601)分别侵染进行毛状根诱导,比较朱砂根叶片毛状根诱导的最适培养基种类、预培养时间、侵染方式、共培养时间以及不同发根农杆菌的致根能力。研究表明:(1)朱砂根无菌叶片毛状根诱导最适培养基为1/2MS培养基,预培养2d、共培养2d,毛状根诱导率最高(31.87%)。(2)最佳侵染方式以剪好的幼叶和活化好的菌液(100mg/L AS)一起在28℃、180r/min黑暗条件下共振荡8~15min。(3)4种发根农杆菌均能诱导朱砂根叶片毛状根产生,但A4、ATCC15834效果最好,其致根能力大小顺序依次为ATCC15834A4LBA9402R1601。(4)PCR分子鉴定表明,发根农杆菌Ri质粒T-DNA已成功整合到宿主细胞核基因组中。     

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85％的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11．8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2．5倍,达1．190mg/g．dry．wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6．7％。     

新疆紫草毛状根的诱导及培养

将处于对数生长期(A600为0.5)的发根农杆菌MSU440、A4、R1000、15834、1025和R1601与新疆紫草子叶外植体共培养.结果表明:(1)发根农杆菌不同菌种对转化率有显著影响,供试6个菌种中只有MSU440菌株获得转化株.PCR及序列分析表明发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已在新疆紫草毛状根基因组中整合并得到表达,转化率达4.5%.(2)子叶较真叶的不定根发生率高,且生根持续时间长.(3)在B5无铵无激素固体培养基上,毛状根分支多且根较长,达2~3 cm,毛状根鲜重月平均增殖达7~9倍,是固体培养毛状根的适宜培养基.(4)毛状根在MS无铵无激素液体培养基中培养12 d时,毛状根鲜重平均增殖达12倍,MS无铵液体培养基有利于毛状根的扩大生产.首次获得了激素自主、快速伸长生长、多分支、多根毛的新疆紫草毛状根株系,初步建立了新疆紫草毛状根诱导体系,为大规模培养、生产紫草素奠定了基础.     

滇黄芩毛状根的诱导及其黄芩苷含量测定

本文利用发根农杆菌A grobacterizum rhizogenes1.2556感染滇黄芩再生苗的茎段和叶片,建立了毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的茎、叶外植体表面产生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根茎段的诱导率较叶片高,最高可达到14.44%;经rolB基因PCR分析和甘露碱纸电泳检测,证明Ri质粒T-DNA已整合到滇黄芩基因组中并表达;毛状根在附加6-BA2mg/L和NAA0.2mg/L的MS固体培养基上直接诱导不定芽,并在MS培养基上生根,形成再生植株。获得的毛状根系经MS液体培养基培养30d后通过HPLC都能检测到黄芩苷,其中1个转化系黄芩苷含量为2.59%,是药材黄芩的0.20倍,而从3年单位时间黄芩苷生成量计算,毛状根是药材黄芩的7.18倍。本研究建立的毛状根培养体系,将对滇黄芩转基因技术的完善和利用毛状根生产黄芩苷的生物转化提供了实验基础。     

发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系的建立

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物后可诱导植物产生毛状根。菠菜(Spinacia oleracea)是常见的食用蔬菜, 目前尚未见菠菜毛状根的研究报道。经筛选得到适合诱导菠菜毛状根的发根农杆菌菌株LBA9402, LBA9402侵染菠菜外植体茎后, 毛状根的诱导率最高可达16%。菠菜毛状根呈白色, 具有丰富的根毛, 能在无外源激素的固体培养基上快速增殖生长。通过诱导菠菜毛状根产生愈伤组织并进行分化, 获得了菠菜毛状根的再生植株, 再生率为8%。此外, LBA9402可将含有Ri质粒的T-DNA和携带外源GFP基因的Ti质粒T-DNA共同导入外植体中。PCR检测和荧光显微观察结果显示, rolB及GFP基因在菠菜毛状根基因组中稳定表达, 共转化频率为50%。     

两种影响因子对葫芦巴发根转化率的影响

葫芦巴（Trigonella foenum-graecum L.）是薯蓣皂素源植物之一,本文以来源于中国山西省的一年生草本植物葫芦巴为实验材料,研究发根农杆菌菌液浓度与超声波辅助处理两个因素对葫芦巴发根转化率的影响。结果显示,随着菌液浓度升高,发根数和发根转化率均逐渐升高,中浓度与低浓度菌液相比,发根数量和转化率分别升高了2.58和3.90倍;利用高浓度菌液侵染获得的发根数量和发根转化率最高,分别是低浓度菌液的7.33和4.32倍。在超声波处理实验中,超声（工作频率40 KHz,超声功率180 W）处理30 s与经未超声处理的对照组相比,发根数量及转化率略有下降;当超声处理60 s时,发根转化率明显上升,为对照组的2.48倍。葫芦巴发根体系的建立可为生产薯蓣皂素以及解析薯蓣皂素合成路径提供一个关键的技术平台。     

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。     

褐脉少花龙葵毛状根的诱导、培养及其澳洲茄胺的产生

利用发根农杆茵的遗传转化和液体培养技术,研究了褐脉少花龙葵(solanum nigrum L.Var.Dauciforum)毛状根的诱导和离体培养及其澳洲茄胺的产生以及液体培养过程中培养基中N源和钙的消耗变化.结果表明.发根农杆菌ATCC15834感染褐脉少花龙葵叶片外植体5 d后产生毛状根.感染25d后,约90%的叶片外植体产生毛状根.毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和体培养基上自主生长.PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rilB和rolC基因已在少花龙葵毛状根基因组中整合并得到表达.所产生的毛状根能产生药用次生物质澳洲茄胺,其含量约为非转化植株根的1.3倍,达到582.05μg/g干重.少花龙葵毛状根液体培养0-5 d内处于生长迟滞期、5-15 d为快速生长期、15d后进入生长平台期.培养基的硝态氮和铵态氮在毛状根液体培养过程中被逐渐吸收和消耗,至培养15 d时铵态氮被消耗殆尽.而硝态氮仍剩余44.7%;培养基中钙的浓度在培养过程中虽逐渐降低,但在培养25d时仍未被完全消耗,其浓度约为起始浓度的43.5%.该结果为今后设计合适的培养基来规模培养褐脉少花龙葵毛状根生产药用次生物质澳洲茄胺提供了可能性.     

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11.8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2.5倍,达1.190 mg/g.dry.wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6.7%。     

Production of diosgenin by hairy root cultures ofTrigonella foenum-graecum L.

Hairy root cultures ofTrigonella foenum-graecum L. were established withAgrobacterium rhizogenes strain A₄. The hairy roots produce diosgenin, an important spirostanol for the semi-synthesis of steroid hormones. Fourteen different liquid media were investigated. The fastest growth was obtained in McCown's woody plant (WP) medium supplemented with 3% sucrose; the highest diosgenin content was observed in half-strength WP medium with 1% sucrose (0.040% dry weight), which represents almost twice the amount detected in the 8-month-old non-transformed roots (0.024%). A time-course study in WP liquid media supplemented with 3% sucrose was undertaken. In these conditions, 17 g diosgenin/g fresh weight were produced. The influence of cholesterol, medium pH and chitosan on diosgenin production was tested. The addition of 40 mg/l chitosan elevated the diosgenin content to three times that found in non-elicited hairy roots.Abbreviations MS Murashige and Skoog (1962) medium - WP McCown's woody plant medium     

Genetic transformation<Emphasis Type="Italic"> of Pueraria phaseoloides </Emphasis>with<Emphasis Type="Italic"> Agrobacterium rhizogenes</Emphasis> and puerarin production in hairy roots

An efficient transformation system for the medicinal plant Pueraria phaseoloides was established by using agropine-type Agrobacterium rhizogenes ATCC15834. Hairy roots could be obtained directly from the cut edges of petioles of leaf explants or via callus 10 days after inoculation with the bacteria. The highest frequency of explant transformation by A. rhizogenes ATCC15834 was about 70% after infection for 30 days. Hairy roots could grow rapidly on solid, growth regulator-free Murashige and Skoog medium and had characteristics of transformed roots such as fast growth and high lateral branching. Paper electrophoresis revealed that bacteria-free hairy roots of P. phaseoloides could synthesize agropine and mannopine. The polymerase chain reaction amplification of rooting locus genes showed that left-hand transferred DNA of the root inducing plasmid of A. rhizogenes was inserted into the genome of transformed P. phaseoloides hairy roots. The content of puerarin in hairy roots reached a level of 1.190 mg/g dry weight and was 1.067 times the content in the roots of untransformed plants.     

青蒿转杜松烯合成酶基因发根系的培养

将已克隆的棉花杜松烯合成酶的ｃＤＮＡ（ｃａｄＣ１４）插入到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,构建含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动下的杜松烯合成酶基因的植物表达载体ｐＢＩＣ１４。用含ｐＢＩＣ１４质粒的发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）１５８３４感染青蒿（ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ．）叶片并诱导发根,共建立１２１个生长迅速的发根系。经浓度为２０ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ筛选,获得１２个抗Ｋａｎ阳性根系。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析表明,外源杜松烯合成酶基因已整合到青蒿基因组中,其转基因频率为３％。ＲＴＰＣＲ分析表明,外源杜松烯合成酶基因在Ｃ３７根系中,在转录水平上已有表达。     

农杆菌转化的小冠花发状根的诱导及其植株再生

利用野生型发根农杆菌15834菌株感染小冠花15日龄无菌苗子叶和下胚轴切段,建立了高效的发状根培养及其体细胞胚胎发生再生体系。发状根可直接从受伤的外植体表面产生,也能在外植体诱导的愈伤组织上发生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上,转化根能自主生长,表现出典型的发根特征。用适宜浓度的乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液2h,感染预培养2d的子叶获得了最高的转化频率(87.4%)。在附加0.2mgL2,4_D,0.5mgLNAA和0.5mgLKT的MS培养基上,发状根能100%形成胚性愈伤组织,并于含0.5mgLKT,0.2mgLIBA和300mgL脯氨酸的MS培养基上顺序经过体细胞胚胎发育的各个典型时期,转换成完整植株。再生植株除具有发达的侧根外,其它形态特征与未转化植株未见明显的差异,但在获得的5个转化克隆中,其中1个的发状根及其再生植株叶片中有毒物质3_硝基丙酸的含量显著下降,分别为未转化对照的57.68%和58.17%。冠瘿碱纸电泳检测和rolB基因PCR扩增检测均证明农杆菌Ri质粒上的T_DNA已经整合到小冠花转化细胞的基因组中。     

银柴胡离体培养与毛状根诱导技术初步研究

以银柴胡茎段为外植体,经消毒获得无菌再生材料后,筛选发根农杆菌介导毛状根诱导产生的最适条件。结果显示：最适的无菌消毒方法为：70%酒精浸5 s,0.1%升汞消毒3 min,获得了银柴胡离体培养材料;以发根农杆菌A4菌株介导的银柴胡毛状根诱导过程中,与叶片和不带腋芽茎段相比,带腋芽茎段为最适转化外植体,用OD600=0.8的菌液侵染茎段15 min,共培养3 d,800 mg/L头孢噻肟钠除菌,其诱导率及诱导密度最高,分别为100%和4.7,为最适诱导条件。研究结果说明在适合条件下,银柴胡带腋芽茎段适于诱导毛状根。