生物素标记的6种cDNA探针检测S180及其克隆细胞株mRNA的表达

目的检测S180及其克隆细胞株S1B11及S2D9mRNA的表达,对这些细胞株进行识别和质量控制.方法用生物素标记的6种cDNA探针,细胞玻片原位杂交的方法检测细胞中mRNA的表达.结果北京市肿瘤研究所(肿瘤所)保存的S180与生物素标记的P16、c-fos、c-myc及c-jun探针杂交阳性,克隆细胞株S1B11与c-fos及c-jun探针杂交阳性,克隆细胞株S2D9与c-fos、c-myc及c-jun探针杂交阳性.结论肿瘤所S180及其2株克隆细胞中mRNA的表达不同,c-myc基因的表达与否可以把S1B11及S2D9克隆细胞区别开;细胞株致瘤性与癌基因表达有关.     

诱发心肌细胞肥大过程中p53和c－myc基因表达的原位杂交研究

利用血管紧张素Ⅱ（ＡｕｇⅡ）诱发下培养的ＳＤ乳鼠心肌细胞（ＭＣ）肥大的模型,采用地高辛配体（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）标记探针的原位分子杂交方法,研究了ｐ５３和ｃ－ｍｙｃ基因在血管紧张素Ⅱ促培养乳鼠心肌细胞肥大中的表达变化。实验分成二组：根据ＡｎｇⅡ持续作用心肌细胞时间,实验组分别于第一天,第三天和第七天终止培养;对照组是相同时期不加血管紧张素培养的心肌细胞。杂交信号用图象分析仪（ＭＩＡＳ３００）进行分析处理,统计结果显示：实验组ｐ５３ｍＲＮＡ的表达水平明显低于对照组,且表达水平与用药时间呈负相关。而ｃ－ｍｙｃ的ｍＲＮＡ在加药促肥大早期（第１天）,表达增高,然后逐渐衰减。结果提示：野生型ｐ５３及ｃ－ｍｙｃ基因均可能参与心肌肥大的病理过程,而ｃ－ｍｙｃ基因在心肌肥大过程中可能是一个始动因素。     

缺血性肾损害时肾小球系膜细胞内皮素A受体mRNA表达的检测

目的　采用夹闭双肾动脉方法建立缺血性肾损害动物模型 ,探讨缺血性肾损害时肾小球系膜细胞内皮素A受体mRNA表达的情况。方法　应用地高辛标记的ETARcDNA探针进行的原位杂交检测肾脏系膜细胞的内皮素A受体mRNA的表达 ,结果　显示缺血性肾损害组动物的肾脏系膜细胞内此素A受体mRNA表达明显高于假手术对照组 ,P <0 0 5。提示 :内皮素可能参与了该疾病的发病过程     

地高辛标记Ucp2基因RNA探针的制备和应用

目的:制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法:提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。     

尾加压素Ⅱ及其受体在肺动脉高压大鼠右心室的表达

目的：观察尾加压素Ⅱ（UⅡ）及其受体UT在慢性低Q高C02肺动脉高压大鼠右心室的表达。方法：健康SD大鼠20只随机分成正常对照组和低氧高二氧化碳4周（HH）组,分别测定平均肺动脉压力（InPAP）,右心室游离壁（Rv）和左心室加室间隔（LV＋S）的重量比;放免法测定大鼠血浆UⅡ含量;免疫组化方法检测心肌细胞、心肌小动脉UⅡ蛋白的表达;组织原位杂交方法检测心肌细胞、心肌小动脉UⅡmRNA和UⅡ受体（UT）mRNA的表达。结果：①HH组InPAP和RV／LV＋S比正常对照组分别高52．0％与25．4％（P均〈0．01）。②HH组血浆UⅡ水平较正常对照组无明显增高。③免疫组化显示HH组心肌细胞UⅡ蛋白表达阳性率和心肌小动脉UⅡ蛋白表达的平均吸光度值均明显高于正常对照组（P〈0．01）。④组织原位杂交可见HH组的心肌细胞UⅡmRNA表达阳性率和心肌小动脉UⅡmRNA表达的平均吸光度值均明显高于正常对照组（P均〈0．01）。⑤组织原位杂交可见HH组的心肌细胞UTmRNA表达阳性率和心肌小动脉UTmRNA表达的平均吸光度值均较正常对照组明显增高（P均〈0．01）。结论：慢性低氧高二氧化碳性大鼠肺动脉高压及右室肥大形成过程中,心肌小动脉和心肌细胞的UⅡ及其受体UT的表达均呈现明显上调,提示UⅡ可能有促进心肌细胞增殖,导致右心室重构的作用。推测UⅡ在慢性低氧高二氧化碳性肺动脉高压及右室肥大的形成机制中具有重要的病理生理意义。     

地高辛标记探针原位杂交检测细胞IL－6受体mRNA表达

地高辛标记探针原位杂交检测细胞ＩＬ－６受体ｍＲＮＡ表达张贺秋，郭宁，任蕴芳，毛宁（北京军事医学科学院基础医学研究所１００８５０）地高辛标记核酸探针技术是８０年代末才发展起来的一种新型的非同位素标记技术，具有灵敏度高、特异性强的优点。我们将地高辛配基标...     

甲低对新生早期大鼠海马及齿状回Goα mRNA的影响

目的：研究甲状腺功能低下（甲减）对围生早期大鼠海马及齿状回Goα mRNA表达的影响。方法：采用地高辛标记寡核苷酸探针原位杂交技术,观察7d龄围生期甲减及正常Wistar大鼠海马CA1－4区及齿状回Goα mRNA的表达状况。结果：7d龄甲状腺激素对围生早期海巴及齿状回Goα 基因的表达具有负调节作用。     

地高辛标记的黄鳝F64基因cRNA探针的制备及其应用

以黄鳝F64基因序列为模板设计引物,扩增用于c RNA探针合成的模板,构建F64/p GM-T重组质粒并线性化,利用RNA聚合酶体外转录合成正、反义c RNA探针,并对其进行地高辛标记,利用原位杂交方法检测F64基因在黄鳝性腺发育过程中的表达变化情况。结果显示,正义探针未检测到阳性信号,反义探针检测到该基因在黄鳝性腺发育早期不表达,于V期性腺开始表达。研究结果表明,体外转录法可以有效合成c RNA探针,制备的c RNA探针可以准确检测F64基因的时空表达。     

人胎儿胸腺内bc1－2基因表达与分布

采用免疫酶组织化学与地高辛标记的单链ｃＤＮＡ探针原位杂交技术,研究了抗凋亡基因ｂｃｌ－２在人胎儿胸腺组织中的表达与分布。结果ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ及其蛋白均优势定位于髓质区。提示胸腺中ｂｃｌ－２基因表达调控发生在转录水平;ｂｃｌ－２基因介导的细胞凋亡状态可能参与Ｔ淋巴细胞的成熟过程。     

黑色素瘤相关抗原家族新基因restin的组织表达谱

Restin是从维甲酸诱导肿瘤分化细胞中克隆的一种黑色素瘤相关抗原家族(MAGE)的新成员.对该基因在不同组织、不同细胞系的表达水平进行研究,将有利于揭示其生物学功能.使用α3-2P-dCTP标记人restin编码区基因作为探针,针对12种不同成人组织mRNA的Multiple TissueNorthern(MTN)膜和含76种成人、胎儿及常用细胞系mRNA的Multiple Tissue Expression(MTE)Array膜进行杂交分析,同时利用地高辛标记探针对11种常见肿瘤组织进行原位杂交检测.结果显示,MTN膜杂交中,12种组织显示均一杂交条带,约1.8 kb,提示该基因可能不存在剪接变异体;MTE膜杂交中,正常组织中均有不同程度的表达,但在肿瘤细胞系中均低表达或者不表达;原位杂交的结果显示,在8种恶性肿瘤组织中均不表达,而在3种良性肿瘤组织中呈现较低的表达.结果提示,该基因在正常组织中的表达明显高于肿瘤组织和肿瘤细胞系,完全不同于其它MAGE-A、B、C的组织表达方式.结合该基因在维甲酸诱导分化的肿瘤细胞中高表达,推测restin可能与正常细胞的分化、增殖有关.     

两种非放射性标记方法在染色体原位杂交中敏感性的比较

通过原位杂交比较了地高辛配基和生物素标记探针,检测染色体单拷贝基因的敏感性。结果表明：在打点检测条上地高辛配基可检出３０ｆｇ低限探针ＤＮＡ,生物素为１ｐｇ。经原位杂交地高辛配基可检测出单拷贝基因,生物素未成功。     

实验性铅中毒对大鼠海马p75基因表达的影响

目的　探讨铅对海马 p75基因表达的影响。方法　采用RT PCR方法 ,半定量分析铅对大鼠海马组织NGFmRNA表达的变化。以地高辛标记的p75cDNA为探针 ,采用原位杂交方法观察铅对大鼠海马 p75mRNA表达的影响。结果　与对照组相比 ,大鼠以 1%醋酸铅经口染毒 8周 ,海马组织 p75mRNA的表达量明显下降 (P <0 0 1)。结论　铅可影响海马 p75基因的表达。     

微小染色体维系蛋白3基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:制备地高辛标记的微小染色体维系蛋白3(MCM3)基因的RNA探针,研究MCM3在斑马鱼早期发育中的时空表达。方法:收集并固定受精后24 h时期的野生型斑马鱼胚胎,提取总RNA,制备DIG标记的MCM3 RNA反义探针,整胚原位杂交,研究MCM3在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果:斑马鱼的MCM3氨基酸序列与小鼠、人具有高度同源性,通过不同时期胚胎的原位杂交,发现MCM3在早期发育过程中普遍性表达,胚胎受精后0~2 hMCM3在增殖性区域泛表达,受精后14~22 h在中枢神经系统、发育未成熟的眼部、体节及增殖性区域表达,受精后24 h在血液、中枢神经、翼板中脑、视觉盖及增殖性区域表达,受精后48 h在头部及肛门增殖性区域表达。结论:明确了MCM3在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,证明其与早期斑马鱼发育细胞增殖密切相关,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

多药耐药基因Mdr1 RNA探针的构建及初步临床应用

检测Mdrl基因表达水平可预测白血病化疗效果,用原位杂交的方法可检测Mdrl在单个细胞的表达水平。本文用Rt-PCR的方法获得了一段特异的cDNA片段,将其克隆到PGEM4Z载体中,经DNA序列分析证明与文献报道一致,采用地高辛素（DIG）RNA标记试剂盒制备反义RNA探针,已初步用于临床骨髓涂片标本的原位杂交检测。     

大鼠Y染色体探针的制备与鉴定

目的:研究制备地高辛标记的大鼠性别决定基因Y区(Y染色体,SRY)探针,用于检测雄性大鼠来源的细胞在雌性受鼠体内的SRY基因表达情况.方法:按已知的雄性大鼠Y染色体上性别决定基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针.以雌性大鼠为对照,原位杂交法检测大鼠肾组织切片Y染色体阳性细胞情况.结果:用原位杂交法证实在雄性大鼠肾脏内有SRY表达,而雌性大鼠肾脏无Y染色体阳性细胞,证实这种探针具有较高的敏感性和特异性.结论:大鼠性别决定基因SRY探针的制备成功,为进一步研究异体雄性大鼠细胞移植后的分布和表达提供了实验基础.     

胃蛋白酶C基因在大鼠胃底腺发育过程中上皮细胞内的表达(英文)

胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体 ,是脊椎动物中普遍存在的非特异性蛋白消化酶 ,胃蛋白酶的生物学特性及分子特性已得到了充分研究。虽然有许多关于胃蛋白酶产生细胞的研究报告 ,但胃蛋白酶原基因在这些细胞的表达却知之甚少。本研究采用地高辛标记的RNA探针 ,用原位杂交的方法研究了大鼠胃底腺中胃蛋白酶产生细胞的个体发育。研究发现 ,大鼠胃腺在胚胎 1 8.5天开始出现 ,但没有形态分化 ;胃蛋白酶的mRNA在出生后 3.5天首次被原位杂交法检出。胃蛋白酶产生细胞在出生后 8周发育成熟 ,胃蛋白酶的mRNA表达在主细胞和颈粘液细胞内 ,其发育可分为 4个阶段 :( 1 )胚胎 1 8.5天至出生后 0 .5天 ;( 2 )出生后 3.5天至 2周 ;( 3)出生后 3周至 4周 ;( 4 )出生后 8周。在胃底腺发育过程中 ,胃蛋白酶mRNA的表达只局限于某种特定的细胞 ,这些细胞的分布具有明确的阶段特异性。因此 ,我们认为胃蛋白酶C可作为胃上皮细胞分化的分子标志。     

玉米(Zea mays L.)中凋亡相关基因c-myc同源序列的检出及其染色体原位杂交定位

原癌基因c-myc是普遍存在于动物组织中的一个高度保守的细胞凋亡相关基因,决定着多种动物细胞的凋亡。我们首次以人c-myc的基因组DNA为探针,用生物素标记的原位杂交和酶联级联放大检测系统在玉米中检出了c-myc基因的同源序列,并对其进行了染色体物理定位。在第5染色体长臂近末端、第4染色体长臂近着丝粒及第1染色体短臂近着丝粒处检测到杂交信号,信号与着丝粒的百分距离分别为96.21±4.46、24.11±0.47和10.02±1.04,本结果为寻找和研究植物细胞凋亡基因提供了重要线索。     

应用小鼠整体原位杂交技术检测MDM2在鼠胚发育不同阶段的表达

整体原位杂交(whole-mountinsituhybridization,WMH)已经成为基因表达定位和表达分布模式研究的一种重要手段.该技术能在整体水平上精确地研究胚胎发育过程中基因表达的三维信息,而且为大规模筛选区域及组织特异性候选克隆提供了有利的技术手段.采用体外转录地高辛标记的RNA探针,检测已知基因MDM2在鼠胚胎发育不同阶段的表达模式.     

地高辛标记寡核苷酸探针检测大鼠胰岛素mRNA

本实验采用地高辛标记前胰岛素寡核苷酸探针原位杂交组织化学技术,研究了Ｗｉｓｔａｒ大鼠胰腺组织胰岛素基因的表达。实验用Ｗｉｓｔａｒ大鼠５只,胰腺经４％多聚甲醛灌注固定,并在同一固定液中后固定２４ｈ,常规石蜡包埋切片。结果表明,经前胰岛素寡核苷酸探针杂交的胰腺切片中,胰岛Ｂ细胞呈蓝色。杂交反应物位于Ｂ细胞的细胞质和部分核仁中,胞核无色。胰岛其它细胞及胰腺外分泌部腺泡细胞无杂交反应物。对照切片中均无阳性信号出现。结果表明地高辛标记寡核苷酸探针不仅具备非同位素标记探针的优点而且能精确检测特异性ｍＲＮＡ的表达。本研究方法操作便利,可靠精确,重复性好。     

整体原位杂交检测ERα基因在小鼠胚胎发育中的表达

为制备地高辛标记的小鼠雌激素受体a(ERa)RNA探针,用其研究ERa在小鼠胚胎发育过程中的表达.通过RT-PCR,获得ERa基因片段,构建ERa/pGEM-3Z重组质粒,分别用Hind Ⅲ和EcpRI进行酶切得到线性化DNA片段,以17和sp6聚合酶合成地高辛标记的正反义RNA探针,然后通过胚胎整体原位杂交技术分析ERa在小鼠胚胎中的表达.结果构建了ERa/pGEM-3Z质粒,获得高效价的正反义digERaRNA探针.运用该探针检测到ERa在10.5 dpc胚胎的前脑、脊神经管、生殖嵴、肢芽及颌弓中表达,在13.5 dpc胚胎的端脑、中脑、脊髓、肢芽及生殖系统中表达,为进一步研究ERa在小鼠胚胎发育中的功能打下了基础.