苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kbDNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究

已经证实苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体结合20kb DNA,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明.研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体,从中抽提出与其结合的20kb DNA.经Nde Ⅰ酶切消化后亚克隆构建文库,通过PCR-RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子.然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接,转化E.coli BL21(DE3),高效表达了141kD蛋白.表达蛋白占总蛋白量的50%以上,且90%以上以包涵体形式存在.利用穿梭载体pHT304构建表达质粒pHTX42,电转化Bt无晶体突变株XBU001,获得重组菌株HTX42,经SDS-PAGE分析,cry1Ac基因得到强表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28%,且其在细胞中累积达细胞干重的64.13%,比文献报道的25%左右高了1倍以上.原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)检测显示,目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体,大小约为1.2 μm×2.0 μm.生测结果显示,包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫均有高效杀虫活性.本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20kb DNA分子的来源、结构和功能奠定了重要的基础.     

双价杀虫蛋白基因在荧光假单胞菌中的表达及增效

利用广宿主质粒载体pJMS6αlac将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因cry1Ac和cry2Aa基因分别及一起进行克隆,将重组质粒导入能在多种作物上定殖、对植物病菌有良好抑菌和防治作用的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)P303菌株,分别得到工程菌株IPP101、IPP201和IPP202。PCRRFLP和Southern blot检测均证明目的基因已经导入了工程菌。SDSPAGE电泳显示工程菌中存在明显的Cry1Ac蛋白带;透射电镜观察发现含cry1Ac基因的两个菌株IPP101和IPP202中杀虫蛋白形成了典型的菱形晶体和蛋白包含体,而在野生P303菌株中均无这些结构。这些结果说明,工程菌中cry1Ac基因得到了很好表达。室内杀虫试验表明：工程菌对棉铃虫初孵幼虫的致死中浓度(LC50),只含cry1Ac的IPP101为000812mL/g饲料,只含cry2Aa的IPP201为002604mL/g饲料,含双基因的IPP202为000186mL/g饲料;HD73为000170mL/g饲料。cry1Ac和cry2Aa双基因表达产物具有显著增效作用,共毒系数达3328。     

苏云金芽孢杆菌4.0718菌株的杀虫晶体蛋白基因分析

根据苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)cry1、cry2和cry3型基因的保守区分别设计了3对通用引物Un1(d)/Un1?、Un2(d)/Un2?和Un3(d)/Un3?,以Bt4.0718菌株质粒DNA为模板进行PCR扩增,通过扩增产物片段的分子量大小来确定该菌株所含有的杀虫晶体蛋白基因类型。随后根据上述3类cry基因的高变区设计特异引物再次进行PCR鉴定。结果表明:Bt4.0718菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Cb、cry2Ac和新基因cry4.5等6种基因类型。这一结果为利用该菌株构建高效广谱杀虫工程菌提供了客观依据。     

芽胞外壁基质组成蛋白的编码基因启动子PexsY指导的cry1Ac基因表达

【目的】利用非cry基因启动子PexsY(芽胞外壁基质组成蛋白编码基因启动子)表达Cry1Ac晶体蛋白,发现可用于cry基因表达的新元件,为高效工程菌的构建奠定基础。【方法】采用启动子融合lacZ技术,通过β-半乳糖苷酶活性分析了PexsY启动子和截短的PexsY启动子的转录活性;利用该启动子在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)HD73菌株中表达了cry1Ac基因,通过透射电子显微镜观察晶体形态;蛋白定量、SDS-PAGE比较蛋白产量;生物活性测定进行功能验证。【结果】PexsY启动子在芽胞晚期转录活性很高,透射电镜观察到利用该启动子表达的cry1Ac基因形成了菱形晶体,SDS-PAGE分析可以检测到133kDa的Cry1Ac蛋白,且与cry3A启动子指导表达的蛋白产量相近,少于cry8E启动子指导表达的蛋白产量;生物活性测定表明PexsY指导表达Cry1Ac蛋白对玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有杀虫活性。【结论】在Bt无晶体突变体中,非cry基因启动子PexsY可以正常表达133kDa的Cry1Ac蛋白,并形成晶体,具有在芽胞形成晚期表达cry基因的能力,该类启动子将在Bt工程菌构建中发挥重要作用。     

杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建

分别以枯草芽孢杆菌大肠杆菌穿梭质粒pHB201和pRP22为载体,通过感受态转化方法,将Bt-HD-1杀虫蛋白基因cry1Ac导入了水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916。工程菌株质粒酶切电泳分析、Southern印迹分析和杀虫生物活性测定结果证实了cry1Ac基因的导入及其在B916中的有效表达。抑菌测定证明工程菌株保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。质粒稳定性分析表明以载体pRP22构建的工程菌株Bs2249具有良好的稳定性,而以载体pBH201构建的工程菌株Bs2014则不稳定。此外,实验还证实Bt基因的导入与表达对B916的生长没有不良影响。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。     

大肠杆菌中利用苏云金芽胞杆菌强启动子p1Ac指导Cry1Ac蛋白表达的特性分析

对利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)强启动子——cry1Ac基因启动子p1Ac指导cry基因在大肠杆菌中的表达进行了研究。结果显示,大肠杆菌中由启动子p1Ac指导表达的Cry1Ac蛋白与苏云金芽胞杆菌来源的Cry1Ac蛋白在碱溶性、胰蛋白酶活化、杀虫活性等方面有较好的一致性,从而解决了目前商业化载体大肠杆菌表达cry基因时形成不易溶解的包涵体问题。同时,还对p1Ac指导的cry1Ac基因在大肠杆菌中表达的发酵条件进行了初步探索。     

一株对苹果树鳞翅目害虫高毒力的苏云金芽胞杆菌YX-1

苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)YX-1是从土壤中分离的对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性的新菌株。为了探索该菌株在果树上应用的可行性,本研究测定了Bt YX-1菌株对苹果树上6种鳞翅目害虫的杀虫毒力,同时对该菌株的晶体形态特征、蛋白型、生长特性、基因型等进行了分析。结果表明,Bt YX-1菌株产生菱形伴胞晶体,SDS-PAGE分析表明该菌株表达的主要蛋白条带分子量约为130ku和60ku;基因型鉴定表明,Bt YX-1菌株含有cry1Ac、cry2Ac、cry1I、vip3Aa和cry34-35基因;生物活性测定表明,Bt YX-1菌株的孢晶混合物对美国白蛾Hlyphantria cunea、棉铃虫Helicoverpa armigera、斜纹夜蛾Prodenia litura、梨小食心虫Grapholitha molesta、苹小卷叶蛾Adoxophyes orana以及苹掌舟蛾Phalera flavescens的LC50分别为14.48、2.72×103、6.24×104、1.01×102、3.52×104、4.73×103mg/L,均低于标准菌株Bt HD-1的LC50。发酵上清液的杀虫活性很低,2龄棉铃虫幼虫的死亡率仅为8.33%,但是该上清液能显著提高孢晶混合物的毒力,说明上清液中含有增效物质。研究结果表明该菌株具有进一步开发为商品制剂的潜力。     

苏云金杆菌辅助蛋白P20对杀虫晶体蛋白Cry1Ab表达的影响

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab因其C半端缺少了一段含4个半胱氨酸的氨基酸序列而导致蛋白的不稳定,报道苏云金杆菌辅助蛋白P20帮助Cry1Ab蛋白的表达及晶体的形成。利用穿梭载体pHT3101构建3个表达质粒,即pT1B、pP1B和pDP1B,3个质粒都含有cry1Ab基因,不同在于pT1B没有p20基因,pP1B含有p20全基因,而pDP1B不仅含有p20全基因,且在p20基因前插入cry1A?启动子。分别将这3个表达质粒经电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型菌株CryB中,获得转化菌株T1B、P1B和DP1B。Western blot表明cry1Ab基因在这3株菌中均表达了130 kD的蛋白,部分降解为大约60 kD的蛋白。蛋白定量分析显示,3株菌130 kD蛋白量的比为1∶1.4∶1.5,降解后的60 kD蛋白量的 比为1∶1.1∶1.6,Cry1Ab蛋白总量的比为1∶1∶2∶1.6。镜检发现,Cry1Ab在3株菌中都形成典型的菱形晶体,其晶体大小为T1B Helicoverpa armigera）均具有明显的杀虫活性,三者的LC₅₀差异不显著。研究表明,P20对cry1Ab基因的表达和晶体形成均有帮助,P20表达量的多少可能是导致Cry1Ab蛋白最终产量有所不同的因素。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ac与烟草几丁质酶tchiB双价基因克隆表达及其杀虫增效作用研究

将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchiB基因 (去掉信号肽或去信号肽再加肠激酶位点)构建了重组基因。经过双酶切和亚克隆,将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315,分别构建重组质粒pHUAccB6、pHUAccB7,在大肠杆菌中扩增后,将两个重组质粒分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株XBU001中,获得重组菌株HAccB6和HAccB7。经液体双相胞晶分离提取离心后,将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析,双价基因重组与cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较,几丁质酶活性提高5.2倍,双价重组蛋白表达量显著提高,主要产生130kDa蛋白条带。经定量分析：双价重组目的晶体蛋白占总蛋白量的61.38%;Cry1Ac蛋白占总蛋白量的42%。发酵上清液经60％硫酸铵沉淀,显示出一条分子量为18kDa新蛋白条带。经原子力显微镜和电子显微镜观察,表达后的重组蛋白呈菱形或椭原形晶体,其规格约为1.5×3.0μm;经生测分析,重组菌株HAccB6和 HAccB7毒力相近,与HAc菌株比较毒力提高4.5倍,对棉铃虫（Helicourpa armigora）具有高效杀虫活性,其3d LC₅₀值分别为9.1μg/mL和11.34μg/mL。研究结果表明,烟草几丁质酶与cry1Ac双价基因重组表达产物具有杀虫增效作用。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ac与烟草几丁质酶tchiB双价基因克隆表达及其杀虫增效作用研究

将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchiB基因(去掉信号肽或去信号肽再加肠激酶位点)构建了重组基因。经过双酶切和亚克隆,将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315,分别构建重组质粒pHUAccB6、pHUAccB7,在大肠杆菌中扩增后,将两个重组质粒分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株XBU001中,获得重组菌株HAccB6和HAccB7。经液体双相胞晶分离提取离心后,将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析,双价基因重组与cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较,几丁质酶活性提高5.2倍,双价重组蛋白表达量显著提高,主要产生130kDa蛋白条带。经定量分析:双价重组目的晶体蛋白占总蛋白量的61.38%;Cry1Ac蛋白占总蛋白量的42%。发酵上清液经60%硫酸铵沉淀,显示出一条分子量为18kDa新蛋白条带。经原子力显微镜和电子显微镜观察,表达后的重组蛋白呈菱形或椭原形晶体,其规格约为1.5×3.0μm;经生测分析,重组菌株HAccB6和HAccB7毒力相近,与HAc菌株比较毒力提高4.5倍,对棉铃虫(Helicourpa armigora)具有高效杀虫活性,其3dLC50值分别为9.1μg/mL和11.34μg/mL。研究结果表明,烟草几丁质酶与cry1Ac双价基因重组表达产物具有杀虫增效作用。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用*

将构建的营养期杀虫蛋白基因vip83表达质粒pBMB2 32 8和含杀虫晶体蛋白基因(cry1Ac1 0或cry1Ca)质粒同时电转化无质粒突变株BMB1 71并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证 ,分别得到含cry1Ac1 0和vip83、cry1Ca和vip83的双基因重组菌BMB2 830 1 71和BMB2 882 1 71。用单基因重组菌作对照 ,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白Cry1Ac1 0和Cry1Ca两组蛋白对 3种重要鳞翅目害     

苏云金芽胞杆菌6618杀虫菌株的分离和鉴定

从我国不同地区采集118份土样,利用温度筛选法分离获得一株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)6618,镜检观察发现该菌株能产生典型的菱形晶体,PCR分析表明其含有cry1类杀虫基因。采用SDS-PAGE和质谱分析发现该菌株主要产生130 k D原毒素,其组分由Cry1Ae和Cry1Ac原毒素组成。基因序列分析表明该菌株的cry1Ac基因为已知的cry1Ac1,而cry1Ae为新型杀虫基因。毒力生测表明该菌株对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有显著的杀虫效果。筛选获得的高毒力Bt菌株6618为丰富我国苏云金芽胞杆菌储备和研发新型高效生物杀虫剂提供了菌株资源。     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

广西大王岭和大明山自然保护区苏云金芽孢杆菌收集与鉴定

从广西大王岭和大明山两个自然保护区共采集到土样264份,共分离出597株芽孢杆菌,通过光学和电子显微镜检观察,16株分离株观察到伴胞晶体蛋白,初步确定为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),出菌率为6.06%.在16株Bt分离株中,有4株在芽孢形成过程中能产菱形晶体蛋白,其余12株能产圆形和其他形状的晶体蛋白.利用PCR-RFLP方法和SDS-PAGE方法对16株Bt分离菌进行了蛋白和基因型的鉴定,结果表明,16株分离株中含有4株cry1Ac基因,表达约130 kD的晶体蛋白,其中含有cry30基因和cry40基因的菌株分别1株和3株,表达大约75 kD的晶体蛋白;另外8株Bt菌株表达蛋白大小不一,其基因型尚不能确定,有待进一步分析.生物测定表明,产菱形晶体含有cry1Ac基因的4株Bt分离株对鳞翅目小菜夜蛾幼虫有很强的毒杀活性,而其它分离株对小菜夜蛾没有毒杀活性.     

农杆菌介导的苏云金杆菌抗虫基因cryIA(b)和cryIA(c)在水稻中的遗传转化及蛋白表达

通过农杆菌介导法用含有抗潮霉素和GUS基因的双元载体将杀虫结晶蛋白基因cryIA(b)和cryIA(c)导入到籼、粳稻幼穗愈伤组织中,然后经过在含有不同浓度潮霉素的培养基上进行数次筛选,获得一批Bt转基因株。经PCR、Southern杂交及Western印迹分析证实此二基因已整合进水稻中,饲虫试验结果表明,转基因株具有100%杀虫率。     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株S184中克隆了2.3 kb大小的vip3A基因并进行了序列分析。将vip3AS184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89 kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19%是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、斜纹夜蛾(S.litura)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3AS184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Southern杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌(\%Bacillus thuringiensis)\% YBT1520菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其5’末端所在HindⅢ片段分别为68kb和46kb,它们对应的基因分别命名为cry218和cry46。经PCR鉴定,该菌含有cry1Aa\,cry1Ab和cry1Ac基因,以及cry2基因,其中cry218属于cry1Ac。分析了cry218基因4190bp的核苷酸序列,在杀虫晶体蛋白基因分类系统中被命名为cry1Ac10。结合Southern杂交和PCR结果可判断3个cry1A基因的拷贝数不同,其中cry1Ac拷贝数最高,YBT1520菌株与其它库斯塔克亚种的杀虫晶体蛋白基因所在限制性内切酶位置明显不同。     

苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达

[目的]本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究.[方法]本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-RFLP鉴定法和SDS-PAGE分析法研究菌株的特性;采用PCR直接克隆法克隆cry2Aa全长基因,并亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-2Aa,再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达;采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾和水稻二化螟的毒力.[结果]经扫描电镜观察菌株Rpp39主要产生菱形、方形和圆形3种伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明主要产生130 kDa和60 kDa左右2种蛋白;经PCR-RFLP鉴定,该菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五类杀虫晶体蛋白基因;1种cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因被克隆,序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902 bps,编码由634个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12.重组表达质粒pET-2Aa在E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65 kDa表达蛋白.生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC50分别为5.4 μg/mL和22.3μg/mL.[结论]菌株Rpp39及从中分离克隆的cry2Aa12基因来自四川生态条件,丰富了菌株及基因的资源,在资源积累方面具有重要意义.     

苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建

[目的]通过比较cry1A、cry3A、cry4A和cry8E四个基因的启动子转录活性,筛选出一个强启动子,利用强启动子构建一个苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)高效表达载体.[方法]利用启动子融合lacZ技术检测了4种启动子的转录活性.通过扫描电子显微镜观察晶体、SDS-PAGE、蛋白定量和生物活性测定等方法对新建高效表达载体进行功能验证.[结果]构建了Pcry1A、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E4个启动子融合报告基因lacZ的表达载体,经β-半乳糖苷酶活性分析得知,启动子活性从高到低依次为Pcry8E＞Pcry1A＞Pcry4A＞Pcry3A.选取cry8E启动子,以pHT315作为基础载体构建苏云金芽胞杆菌高效表达载体pHT315-8E21b,将cry1Ac基因连接到pHT315-8E21b和广泛应用的cry3A启动子指导的pSXY-422b上,分别转入无晶体突变株HD-73-,获得菌株HD-8E1Ac和HD-422-1Ac.扫描电子显微镜观察显示,HD-8E1Ac菌株可以形成菱形晶体,说明正确表达了cry1Ac基因.SDS-PAGE分析结合蛋白定量实验表明pHT315-8E21b表达效率高于pSXY-422b.对小菜蛾(Plutella xylostella)的生物活性测定表明HD-8E1Ac菌株对小菜蛾有生物活性,且菌株活性高于HD-422-1Ac.[结论]利用强启动子Pcry8E构建了一个能在Bt中高效表达的穿梭载体pHT315-8E21b,该载体可正确表达cry1Ac基因,其表达效率高于被广泛应用的pSXY422b.