苏云金芽孢杆菌S1478-1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的Bt菌株S1478-1进行了特性鉴定,研究表明S1478-1分离株菌落形态和生长特征和Bt参照菌株HD73极其相似.16S rDNA序列分析表明,S1478-1分离株与其它B.thuringiensis、B.cereus和B.anthracis的16S rDNA序列相似性达到99%.分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130 kD大小的晶体蛋白.生物测定表明S1478-1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50卯值高达5.159 ×108cfu/mL.初步显示S1478-1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株.利用PCR-RFLP方法鉴定S1478-1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3 537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133.3 kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99%同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因.     

粪产碱菌nif H,nif D和部分nif K的克隆、定位及序列分析

提取粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)总DNA,经限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳,以含肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)nif H和nif H-D基因的DNA片段为探针进行Southern杂交,筛选出与nif HDK同源的4.6kb片段,克隆到pBluesript SK~+载体上,构建了重组质粒pBZl.经亚克隆、酶切、DNA序列分析后发现,粪产碱菌具有与其它固氮菌相似的结构特征,其nif HDK共用1个启动子,具有上游激活序列UAS,RNA聚合酶σ⁵⁴因子识别序列、1个A-T富集区和SD序列.nifH和nif D的阅读框架分别为888和1476bp,GC含量各为61.6%和60.2%.nifH-nif D和nif D-nif K的基因间隔区长度分别为101和105bp,各存在1个7bp的反向重复和1个SD序列.由阅读框架(ORF)推导的铁蛋白和钼铁蛋白α亚基的氨基酸序列与其它固氮菌相比有较高的同源性,高度保守的氨基酸残基所处的位置也很相似.同源性比较说明,粪产碱菌与棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)同源性最高.     

海南岛热带雨林区芽孢杆菌收集及Bt菌鉴定

本研究系统地对海南岛热带雨林自然保护区进行了土壤样品的采集、芽孢杆菌的分离收集和Bt菌株的鉴定.从尖峰岭热带雨林区、五指山热带雨林区、吊罗山热带雨林区、霸王岭热带雨林区总共采集了土壤样品1 882份,采用醋酸钠培养基结合高温方法分离出芽孢杆菌3 924份,鉴定出Bt分离株158份,Bt菌株的分离率和出菌率分别为4.03%和8.40%.结果分析表明,海南岛热带雨林区芽孢杆菌及Bt菌株分布对环境和生态表现出一定的规律性,一般海拔900 m至1 400 m的Bt菌株含量高、植被覆盖率高,土壤腐殖质含量高的热带沟谷雨林带Bt菌株含量最高.显微观察发现,获得的Bt菌株其伴胞晶体有菱形、球形、方形、椭球形、不定性等多种形状.利用SDS-PAGE方法对获得的Bt分离株进行了伴胞晶体进行分析,发现伴胞晶体的分子量有20 kD到150 kD不等.进一步利用PCR-RFLP技术对Bt分离株进行了cry基因型的分析,初步发现这些Bt菌株含有cry1、cry3、cry4、cry6、cry30、cry40等基因型.我们还利用鳞翅目昆虫小菜蛾和鞘翅目昆虫椰心叶甲进行部分Bt分离株的生物测定,初步结果显示本研究鉴定出的Bt分离株具有不同的抗虫靶标,对同一靶标昆虫也表现出不同的杀虫活性.整体而言,本研究结果显示出海南岛热带热带雨林自然保护区因其独特的热带地理生境、自然的生物演化系统,使得热带雨林区蕴藏了Bt菌株资源多样化,值得期待挖掘出一些新的菌株和新的基因资源.     

广西大王岭和大明山自然保护区苏云金芽孢杆菌收集与鉴定

从广西大王岭和大明山两个自然保护区共采集到土样264份,共分离出597株芽孢杆菌,通过光学和电子显微镜检观察,16株分离株观察到伴胞晶体蛋白,初步确定为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),出菌率为6.06%.在16株Bt分离株中,有4株在芽孢形成过程中能产菱形晶体蛋白,其余12株能产圆形和其他形状的晶体蛋白.利用PCR-RFLP方法和SDS-PAGE方法对16株Bt分离菌进行了蛋白和基因型的鉴定,结果表明,16株分离株中含有4株cry1Ac基因,表达约130 kD的晶体蛋白,其中含有cry30基因和cry40基因的菌株分别1株和3株,表达大约75 kD的晶体蛋白;另外8株Bt菌株表达蛋白大小不一,其基因型尚不能确定,有待进一步分析.生物测定表明,产菱形晶体含有cry1Ac基因的4株Bt分离株对鳞翅目小菜夜蛾幼虫有很强的毒杀活性,而其它分离株对小菜夜蛾没有毒杀活性.     

采用苯酚羟化酶基因特异引物检测苯酚降解菌

根据苯酚羟化酶基因高度保守序列设计了一对该基因的特异PCR引物。采用该特异引物从苯酚降解菌醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)PHEA 2的总DNA中扩增到唯一一条大小为 684bp的片段。该DNA片段与已知的A .calcoaceticusNCIB82 50的苯酚羟化酶基因具有高度的同源性 ,其核苷酸序列的同源性为 84% ,推导的氨基酸序列的同源性为 98%。对苯酚和非苯酚降解菌株的PCR扩增结果表明 :所有苯酚降解菌均能扩增出 684bp的特征片段 ,而非苯酚降解菌则无PCR条带。对炼焦废水中的细菌群落进行PCR扩增和生化特性检测表明 :显示 684bp特征片段的菌株均具有苯酚降解特性。上述结果表明 ,利用苯酚羟化酶基因的特异引物可对环境中的苯酚降解菌株进行准确快速的PCR检测。     

应用FTIR和NMR研究短梗霉多糖分子结构

短梗霉多糖是出芽短梗霉产生的一种胞外多糖,具有极好的成膜、成纤维、阻气、粘接、易加工、无毒性等特性,是微生物多糖中最令人瞩目的多糖之一．本研究应用ＦＴＩＲ和ＮＭＲ技术对由出芽短梗霉胞外产生的短梗霉多糖进行了分析．短梗霉多糖的红外光谱（４０００～４００ｃｍ－１）,具有明显的多糖特征吸收峰,证明多糖是由α－Ｄ－吡喃葡萄糖残基组成．应用先进的一维和二维核磁共振技术,在绝对温度３４３Ｋ下获得短梗霉多糖１Ｈ－ＮＭＲ谱和１３Ｃ－ＮＭＲ谱,确证短梗霉多糖的结构单元是α－１,４麦芽三糖,归属了短梗霉多糖的１Ｈ和１３Ｃ的全部化学位移     

雄性可育与雄性不育籽粒苋小孢子发育研究

栽培种籽料苋（lmaranthus hypochondriacus L。）是一种很有潜力的新型作物。它营养价值高、蛋白质含量丰富、氨基酸平衡好、耐旱、耐盐碱和酸、抗逆性强、适应性广,被认为易极有潜力的、为全球提供粮食的替代作物之一。但是籽粒苋于粒重仅0．7－1．2g,种子易散落。于是,和许多其它植物一样,籽粒苋中也找到了雄性不育株。但是它的小孢子发育过程及其败育时期和不育特征尚不清楚,为它的杂交育种研究带来不便。本文通过电镜对雄性可育和不育的两种籽粒苋小孢子进行观察。发现不育小孢子败育起始于四分体释放以后的单核花粉期。在此之前小孢子的发育是一样的。花粉分化早期,孢原组织分化出初级造孢组织、绒毡层、中间层、药壁内层和表皮层（图1）;造孢组织继续分裂,细胞不断扩大,形成小孢子母细胞（图2）;小孢子母细胞不断增大,周围积累胼胝质并逐渐与绒毡层分离,出现大液泡（图3）;小孢子母细胞减数分裂,四分体形成,包埋于胼胝质中;绒毡层有丝分裂,有双核细胞;大液泡消失;细胞壁开始降解（图4）。胼胝质逐渐消失,小孢子从四分体中释放以后（单核花粉期）,在雄性可育籽粒苋里,小孢子有丝分裂、迅速膨大变圆,可见两个深色雄仁,花粉壁加厚（图5）;进入收缩期,绒毡层降解,突入花药腔,环绕小孢子周围（图6）;花粉壁不断加厚,小孢子更趋成熟（图7）,直直形成内含大量淀粉的完全成熟花粉粒（图8）。而在雄性不育籽粒苋里,出现如下不育特征：小孢子粉壁未能进一步加厚,小孢子形状变得怪异（图13）;花粉内含物溶解,空泡化,成为不育花粉（图14）。小孢子在花药中的发育完全依赖绒毡层细胞提供所需的营养物质和信息,绒毡层异常必然导致花粉败育,胼胝质降解不影响小孢子母细胞减数分裂,而是影响小孢子初生外壁的发育,从而导致小孢子发育退化。籽粒苋花粉败育过程中未见胼胝质降解,其原因有待进一步研究。有报道,正常花粉发育过程中常含有大量液泡,籽粒苋可育花粉的发育过程也证实液泡的发育与花粉粒的充实、花粉的形状有密切关系,而不育花粉中小液泡逐渐膨大,形成空泡后破裂。     

来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析

本研究采用琼脂糖凝胶电泳对分离白海南岛的12个Bt菌株与分离自广西、黑龙江的5株Bt菌株及2株Bt模式菌株进行质粒数量、大小等特征分析.19个供试菌株可区分为16种独特的质粒电泳图谱,充分显示出不同来源bt菌株的质粒多样性.进一步选择了其中的10个菌株,利用包埋法制备琼脂块进行脉冲场凝胶电泳(PFGE),结果表明苏云金芽孢杆菌大质粒组成特征也具有丰富多样性.但是供试菌株的质粒电泳图谱并未体现与地理和生态特征相关联的特征差异.研究结果初步证实海南分离株S3078-1是一株无内生质粒的Bt菌株,而S3031-1和S3073-1两个分离株仅有一个大质粒存在,这三个分离株将为进一步研究质粒功能提供初始菌株.本研究进一步暗示将琼脂糖凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳结合起来研究质粒特征提高了结果的可靠性.     

基于基因组与蛋白组分析挖掘高效杀虫菌株Bt S2480-1毒蛋白基因

[目的]鉴定苏云金芽孢杆菌野生型菌株Bt S2480-1的杀虫活性并挖掘该菌株含有的杀虫基因资源。[方法]采用Illumina Hiseq2000测序平台对Bt S2480-1菌株进行全基因组测序,通过生物信息学方法获得该菌株的基因组信息、基因预测以及毒蛋白基因预测识别;随后,利用LTQ-Obitrap nano-LC-MS/MS系统对该菌株的总蛋白进行了质谱分析;最后以致倦库蚊幼虫和甜菜夜蛾幼虫为靶标昆虫对该菌株进行了生物活性测定。[结果]Bt S2480-1基因组大小为6.2 Mb,GC含量为35.11%,拼接得到1个拟核和3个大质粒的可视化草图,预测编码基因6 297个,其中含有12个预测毒蛋白基因。Bt S2480-1菌株总蛋白在LTQ-Orbitrap MS/MS质谱分析中共有 1500个蛋白质获得鉴定,鉴定获得11个毒蛋白。Bt S2480-1菌株总蛋白对致倦库蚊幼虫表现出非常高的杀蚊活性,而对甜菜夜蛾幼虫杀虫活性相对偏弱,其LC₅₀分别为27.636 μg/mL (95% FL:12.559‒61.707μg/mL)和496.833 μg/mg (95% FL:320.134-776.964μg/mg)。[结论]Bt S2480-1菌株基因组分析显示共含有12个预测毒蛋白基因,LTQ-Orbitrap MS/MS鉴定获得11个毒蛋白,Bt S2480-1菌株总蛋白对致倦库蚊和甜菜夜蛾幼虫都具有杀虫活性。     

大豆粒形性状的遗传效应分析

采用双子叶植物种子数量性状的遗传模型,分析了大豆品种双列杂交F1和F2种子的粒重、粒宽、粒厚和粒长／粒宽、粒长／粒厚、粒宽／粒厚粒形性状的遗传效应。结果表明：7种粒形性状同时受制于种子直接遗传效应,而且还不同程度的受制于母体和细胞质效应。其中,百粒重、粒长、粒长／粒宽、粒长／粒厚和粒宽／粒厚的遗传以细胞质效应为主;粒宽和粒厚以母体遗传效应为主。粒重、粒长和粒长／粒宽、粒宽／粒厚的种子直接遗传率和细胞质遗传率均属中等,对其4个性状选择可以在较高世代单株和单粒选择均有效果。粒宽和粒厚母体遗传率数值较大,对其性状应以母体单株为单位早代选择,以增加粒宽和粒厚。P2和P7可作为增加百粒重、粒长／粒宽、粒长／粒厚和粒宽／粒厚的理想亲本;P1、P4和P6分别是提高粒长、粒厚和粒宽的理想亲本。