谷胱甘肽的合成与其活性初步评价

先采用Fmoc固相多肽合成法,以2-Chlorotrityl chloride(2-CTC)树脂做载体,DIC/HOBt做缩合剂,逐步缩合得到全保护谷胱甘肽树脂,以TFA/EDT/m-Cresol为裂解液脱除保护基团,粗肽经半制备反相高效液相色谱法纯化得α-GSH、γ-GSH纯品,后将所得γ-GSH纯品分别采用空气,双氧水,碘氧化得GSSG,经纯化得GSSG纯品,合成的α-GSH、γ-GSH纯品纯度达99%,GSSG纯度达98%,利用标准品,经外标法计算总收率分别为60%、64%、57%。并观察三者对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的治疗效果结果显示都能显著降低ALT与AST的活性,且与注射用γ-GSH没有显著性差异,可以为工业化生产提供借鉴。     

吸附柱层析法制备纯化茶多酚中EGCG单体

以茶多酚为原料,采用吸附树脂柱层析法制备表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)单体。考察树脂对儿茶素的吸附容量、吸附率、解吸率及吸附选择因数,选择LX-8树脂初步纯化后采用HP-20树脂二次纯化。经LX-8两步柱层析,1.5 BV/h流速洗脱,25%乙醇洗脱组分上柱后经40%乙醇洗脱5 BV可得到纯度为73.06%的EGCG产品。以20 mg/mL浓度的LX-8柱40%乙醇产品上HP-20柱,1.5 BV/h洗脱,5%乙醇洗3 BV,15%乙醇洗6 BV,80%乙醇洗3 BV后,可制得纯度为93.16%,总收率为49.50%的EGCG产品。     

α- 促黑激素的固相合成研究

目的:探索α-促黑激素的合成工艺。方法:采用多肽固相合成法制备α-促黑激素。以Rink amide-MBHA树脂为载体、使用Fmoc保护策略、TBTU、HOBt、DIEA为缩合剂体系,最后用TFA、苯甲硫醚、水、苯酚、乙二硫醇混合液将多肽从树脂上切割下来。结果:合成后的目标多肽产率达64.9%,经过RP-HPLC纯化纯度可达98%,质谱鉴定显示纯化产物与目标多肽理论相对分子质量一致。结论:该方法操作方便,反应结果稳定,为固相合成生产α-促黑激素提供了一种可行的工艺方案。     

固相法合成多肽AN-M的工艺研究

目的:探讨生物活性肽AN-M的固相合成工艺,并为工业化合成目的肽提供理论依据。方法采用固相法,以Fmoc-保护基保护的α-氨基酸和Wang树脂为原料,经1—氧—3—双二甲胺羧基苯骈三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、1—羟基苯并三氮唑(HoBt)、二异丙基乙胺(DIEA)缩合,20%哌啶的DMF溶液脱保护,用切割试剂将AN-M粗品从Wang树脂上切割下来。结果经反相高效液相色谱分析纯化,可得目的肽的得率大于67．00%,最终成品的纯度在98．78%以上,经质谱鉴定其分子量与理论值一致。结论该合成方法步骤简便、便于操作、产品得率高,可用于大规模合成目的肽。     

猴头多糖分离纯化的初步研究

目的：确定适合于猴头多糖分离纯化的方法。方法：以液体发酵生产的猴头菌丝为材料,提取猴头菌丝多糖进行分离纯化,以得到多糖纯品。结果：猴头菌丝粗多糖采用Sevag法除蛋白的次数应该控制在5-8次,而且Sevag法除蛋白所得的HMP,经DEAE-纤维素柱层析初步纯化,多糖主要分布在蒸馏水洗脱部分,命名为HMPⅠ,其含量为67.5%;HMPⅠ经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化,得到两个组分：HMPⅠa、HMPⅠb;HMPⅠa为多糖主要组分,含量为71.8%;HMPⅠa经纯度鉴定为多糖纯品。结论：DEAE-纤维素柱层析结合Sephadex G-100凝胶柱层析的纯化方法,可以获得猴头多糖纯品。     

重组人干扰素α2b的提取和纯化

为了提高重组人干扰素α2b的质量 ,增加产量 ,降低成本 ,通过破菌 ,包涵体提取 ,离子交换层析 ,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。结果表明干扰素纯度可达 95%以上 ,比活达到 1.2× 10 8IU/mg以上。结果提示 ,采用本方法收率高 ,纯度好 ,工艺稳定 ,适合大规模生产     

杂环肽FIK的Fmoc固相合成法研究

为研究二硫键成环的杂环肽FIK的合成工艺, 以Fmoc氨基酸为原料, 采用固相合成法, 经TBTU/HOBT/DIEA复合缩合剂催化合成直链肽, 再经I2氧化肽链上两个半胱氨酸的巯基生成分子内二硫键而得到目标环肽, 将其用切割试剂切割脱离树脂得到粗产品, MALDI-MS和RP-HPLC进行鉴定, 分析和纯化。产率可以达到18%, 纯化后纯度达97%以上, 经MALDI-MS和Ellman试剂检测确定为目标肽。该合成法高效, 简便, 快速, 目标肽收到较理想产率, 适合大批量生产。     

杂环肽FIK的Fmoc固相合成法研究

为研究二硫键成环的杂环肽FIK的合成工艺, 以Fmoc氨基酸为原料, 采用固相合成法, 经TBTU/HOBT/DIEA复合缩合剂催化合成直链肽, 再经I2氧化肽链上两个半胱氨酸的巯基生成分子内二硫键而得到目标环肽, 将其用切割试剂切割脱离树脂得到粗产品, MALDI-MS和RP-HPLC进行鉴定, 分析和纯化。产率可以达到18%, 纯化后纯度达97%以上, 经MALDI-MS和Ellman试剂检测确定为目标肽。该合成法高效, 简便, 快速, 目标肽收到较理想产率, 适合大批量生产。     

Bacillus amyloliquefaciens ES-2发酵产抗菌脂肽消泡剂的筛选及脂肽的提取和纯化

将大豆油、有机硅消泡剂和聚醚类消泡剂3种消泡剂分别用于Bacillus amyloliquefaciens ES-2抗菌脂肽发酵,研究表明大豆油既可以实现消泡,又有利于抗菌脂肽的发酵,使其产量达到了2497.67mg/L。经过提取得到纯度为55.68%的产品,提取率达到88.72%。此外还比较了不同大孔树脂对抗菌脂肽吸附和解吸附效果,发现大孔树脂X-5最适合抗菌脂肽的纯化。纯化的工艺参数为:上样浓度14.4mg/ml、上样速率1ml/min,洗脱速率2ml/min、洗脱剂用量2.5BV,产品的回收率达90.01%,纯度达74.4%。     

一种人新型基因工程干扰素rh-IFNα-m的高效表达、纯化和活性检测

为实现干扰素 (IFNα m)的高表达与纯化 ,研究其抗病毒、抗增殖活性。应用PCR技术将已构建的IFNα m的高表达基因亚克隆到原核表达载体pBV2 2 0上 ,构建表达质粒 pBV2 2 0 /IFNα m ,转化大肠杆菌DH5α进行表达。表达产物经初步检定以包涵体形式存在 ,包涵体进行变性、复性 ,然后经CM Sepharose FF、DEAE Sepharose FF离子交换层析和Sephacryal HR10 0分子筛纯化 ,获得较纯的干扰素IFNα m。以IFNα 1b为对照 ,在VSV Wish系统上采用细胞病变抑制法 ,测定纯品IFNα m的抗病毒活性。在Hela细胞上用MTT法进行抗增殖实验。结果表明包涵体含量占菌体总蛋白 4 0 % ,纯化的目的蛋白IFNα m纯度在 95 % ,比活高达 1 2 6× 10 7IU/mg ,纯化收率34 4 % ,IFNα m抗病毒活性和IFNα 1b相当 (P >0 0 5 ) ,抗增殖活性高于IFNα 1b(P <0 0 1)。     

Beta proteobacterium sp.T1菌株产壳聚糖酶的分离纯化

目的:分离纯化Beta proteobacterium sp.T1菌株所产的壳聚糖酶.方法:采用(NH4)2SO4(20%～70%)分级盐析、阴离子交换树脂DEAE Cellulose 52柱层析、SephadexG-100柱层析技术进行分离纯化,采用SDS-PAGE鉴定酶的纯度、分子量.结果:经DEAE Cellulose 52柱层析,壳聚糖酶纯化了13.19倍;经Sephadex G-100柱层析,壳聚糖酶纯化了26.32倍.结论:纯化后的酶经SDS-PAGE鉴定已达到电泳纯,分子量29.5kDa.     

重组人r干扰素的纯化及其N端氨基酸序列分析

本文对两个重组人γ干扰素高效表达株pIFN-γ及PBVIFN-γ的表达产物进行了纯化并对纯化的γ干扰素进行了活性鉴定及N端氨基酸序列分析。采用连续沉淀的方法对高表达菌株pBVIFN-γ及低表达菌株pIFN-γ,裂解液进行初步纯化,然后应用单克隆抗体亲和层析方法进行纯化,分别可纯化14倍与933倍,均达电泳纯,回收率分别为25％和30％,比活性达7.56×10~7U/mg蛋白。SDS-PAGE电泳上γ干扰素分子量约17.5kD。测定了纯化的γ干扰素N末端19个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致,确认了本研究所表达、纯化的γ干扰素达到了较高纯度。本方法为γ干扰素的批量生产奠定了基础。     

面包树果实凝集素的提取纯化及理化性质分析

建立面包树果实凝集素(frutalin,FTL)的提取纯化方案,并对FTL纯品进行部分理化性质分析。本试验以新鲜的面包树果实籽为材料,经Tris-HCl缓冲液浸提、过滤、硫酸铵沉淀和阳离子交换层析后超滤浓缩得FTL纯品,最后用纯品开展了糖抑制,热稳定性,pH稳定性和金属离子耐受性等试验。提取优化得到的最佳条件为:料液比1∶2(g:m L),浸提时间2 h,浸提温度50℃,硫酸铵饱和度70%,沉淀时间4 h。经阳离子交换层析后FTL回收率为22%。研究结果表明,FTL是一种热稳定性凝集素,在温度不超过60℃时,其凝血活性不受影响,并且不依赖于金属离子来发挥其凝血活性。本研究建立了一个简单高效的FTL分离纯化方案,并对FTL纯品做了部分理化性质研究,为FTL可能的生物医学应用提供研究基础。     

正交试验法优化加杨树皮中白杨素的纯化工艺

以白杨素纯度为指标,采用L_(9 )(3~4)正交试验法,考察聚酰胺柱层析的洗脱溶剂、上样浓度、上样量及流速对杨树皮中白杨素纯度的影响,优化聚酰胺纯化工艺。最佳工艺条件为:以60-80目的聚酰胺装柱,以60%乙醇为流动相,上样浓度为稀释3倍的经石油醚冷浸脱脂后的杨树皮总酚酸流浸膏,上样量与聚酰胺柱的体积比为1∶2,吸附流速20 ml/min,洗脱流速为80 ml/min。收集60%乙醇溶液洗脱部位,经重结晶可得白杨素粗品。该纯化工艺简单、合理,是杨树皮中白杨素的最佳纯化工艺。     

Eremomycin的发酵条件优化及发酵产物的分离纯化

研究确定Nocardia orientalis NRRL18098发酵生产eremomycin的最佳工艺条件,以及对发酵产物进行分离纯化并得到eremomycin的纯品。通过正交设计方法优化发酵培养基的组成。采用树脂吸附、中压液相色谱技术相结合的方法对发酵产物进行分离纯化。在优化条件下,eremomycin的摇瓶发酵单位达115 mg/L,提高了63.5%,并采用树脂吸附和中压液相色谱相结合的方法能有效地将eremomycin从发酵液中分离出来,制备获得eremomycin精制品。     

微生物发酵产生的番茄红素的分离纯化

研究了三孢布拉霉(Blakeslea trispora)发酵产生的番茄红素的分离纯化方法。与植物源的番茄红素相比,真菌发酵产物中含有更多的油脂成分,且提取物中含有的一些同分异构体与产物性质类似而不易分离。实验采用溶剂抽提、大孔吸附树脂吸附法纯化以及结晶的方法可获得番茄红素晶体,纯度达70.9%,收率为64.6%。产品经重结晶后可获得纯度90%以上的番茄红素,经红外、核磁、质谱等证实与植物来源的番茄红素相一致。     

解淀粉芽孢杆菌Q-426群体感应系统ComX信息素前体肽的合成研究

采用Fmoc固相合成法合成了解淀粉芽孢杆菌Q-426群体感应系统Com X信息素的前体五肽。利用反向半制备色谱(RP-HPLC)和液质联用仪(LC-MS)对合成的五肽进行了分离纯化及纯度分析。建立了检测游离氨基酸的新方法,并详细考察了合成条件对树脂上肽链连接效率的影响。结果表明,新型NNA试剂(茚三酮+正丁醇+乙酸溶液)可替代传统的Kaiser试剂用于Fmoc固相合成中游离氨基的检测;在35℃下,使用DCM和DMF对树脂交替溶胀1h后,树脂上肽链的连接效率最高。合成的Com X信息素前体五肽粗品产率为98%,纯度为58.60%;经半制备型高效液相纯化后,纯度达99%。抑菌实验表明,Com X信息素前体五肽具有明显的生物活性。     

大孔吸附树脂纯化亚麻木酚素

以纯化亚麻木酚素粗品为目的,比较了X-5、D101和AB-8三种大孔吸附树脂对木酚素的吸附性能,筛选出X-5大孔树脂最合适。通过动态吸附、解吸实验确定了上样浓度与上样量。在上样浓度10 mg/m L,上样量25 m L时分离效果最佳。同时,重点考察了梯度洗脱和等度洗脱两种解吸方式对木酚素产品纯度和收率的影响。等度洗脱采用30%乙醇水溶液,木酚素纯度可达85.49%,收率为57.59%;采用60%乙醇水溶液洗脱,木酚素纯度为59.30%,收率最高为75.05%。梯度洗脱可得到不同纯度产品,过程总收率为77.63%。     

尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

尿酸氧化酶(urate oxidase,Uricase,EC.1.7.3.3)是一种能将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。合成黄曲霉(Aspergillus flavus)尿酸氧化酶基因,构建表达载体pET43.1a/uox,重组质粒经双酶切鉴定和序列分析,证明插入序列正确,转化到大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,菌株经诱导表达尿酸氧化酶蛋白,目的蛋白经过超声破碎,经检测以可溶性蛋白为主;菌体经超声破碎后,上清经过阴离子柱和阳离子柱两步纯化,得到尿酸氧化酶纯品,纯品以分光光度法进行体外酶活性测定。结果显示:尿酸氧化酶在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白的50%;表达产物经过两步层析柱纯化,获得电泳扫描纯度为95%的纯品;在体外活性测定中具有分解尿酸的能力,在临床检测和治疗中有重要意义。     

固相合成hTGF-α类似物及其结构—活性关系初探

本文用手动逐步法,以Boc-Ala-OCH_2-Pam树脂为载体,Boc保护的α-氨基酸为原料合成了十一个hTGF-α(人体转化生长因子-α)类似物。经过HF裂解、透析、二硫键配对合环及HPLC纯化,得到平均收率为2.9％的纯品,其氨基酸组成分析及质谱数据均符合要求。在构效关系研究中,将合成的hTGF-α类似物进行与A431细胞膜上的EGF受体竞争性结合的试验。以半抑制浓度(IC-50)为指标,发现Tyr~(38)及Arg~(42)二个残基对hTGF-α竞争性与EGF受体结合的活性具有突出的作用。