重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究

α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80～150U／mL,蛋白浓度为3～4.5mg／mL,比活性约为20-30U／mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98％以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。     

B→O血型转变工具酶α-半乳糖苷酶cDNA克隆及表达

 α-半乳糖苷酶是实现 B→O血型转变、制备通用型血的关键工具酶 .利用反转录 PCR方法从中国海南 Catimor咖啡豆中克隆α-半乳糖苷酶 c DNA,插入嗜甲基酵母 P.pastoris分泌表达载体 p PIC9K中 ,转化 P.pastoris GS1 1 5,筛选高表达重组菌株 .经甲醇诱导表达 7d后 ,发酵液总蛋白分泌量约 1 .2 mg/ml,SDS- PAGE呈现约 41 k D特异表达带 ,与专一性底物对 -硝基 -苯基 -α- D-吡喃半乳糖苷反应证明 ,表达产物具有 α-半乳糖苷酶活性 ,最高达到 1 8U/ml.初步实验表明 ,表达的 α-半乳糖苷酶可酶解 B型红细胞 ,成功实现 B→O血型转变 .     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α-半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上,尝试了基因工程α-半乳糖苷酶在5 L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。在4 L无机盐培养基中接种0.4 L pPIC9K-Gal/GS115培养物,最终得到3.5 L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为2.1 g/L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点,设计了如下的纯化流程：离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带,总回收率41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明,从发酵液中纯化的α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α-半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

表达重组咖啡豆α-半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵

用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础.     

新型α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的：制备高效价、高特异性的新型α-半乳糖苷酶的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法：用脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫新西兰大白兔,获得α-半乳糖苷酶的兔抗血清,并经HiTrap rProteinA柱纯化获得高纯度的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹评价抗体的特异性。结果：通过免疫法得到了α-半乳糖苷酶的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1：1×10^6,经rProteinA柱纯化后获得了高效价、高纯度的抗体,Western印迹显示该抗体特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合。结论：获得了新型α-半乳糖苷酶的高效价、高特异性的兔多克隆抗体,可用于血型转变过程中残留α-半乳糖苷酶含量的特异性检测。     

利用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体

目的:采用一种简单易行的纯化方法获得高纯度α-半乳糖苷酶单克隆抗体。方法:使用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶捕获和纯化小鼠腹水中的α-半乳糖苷酶单克隆抗体。结果:获得了高纯度、高效价的α-半乳糖苷酶单克隆抗体。结论:应用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体是一种简单、有效的方法。     

一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag 的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag 的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。     

α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面的α-Gal抗原

目的:探讨脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面α-Gal抗原的作用。方法:用不同浓度的α-半乳糖苷酶酶解猪红细胞、猪胚肾细胞PK15、猪睾丸细胞ST和原代培养的猪成纤维细胞上的α-Gal抗原,酶解温度为26℃,作用时间为2 h;用25μg/m L的FITC-IB4凝集素标记酶解前后的细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面α-Gal抗原的清除率。结果:流式细胞检测结果表明,不同组织来源的猪细胞表面的α-Gal抗原的表达量明显不同,所需酶的剂量也不同,但其表面的α-Gal抗原均能被α-半乳糖苷酶清除。结论:脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶可以清除猪细胞表面的α-Gal抗原,提示该酶对降低异种移植引起的超急性排斥反应有重要意义。     

一种来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶的理化性质及其酶解B型红细胞的工艺研究

利用α-半乳糖苷酶去除红细胞表面的B抗原是制备通用O型红细胞的有效方法.本文在克隆表达纯化脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶的基础上对其理化性质进行了研究,该酶的分子量为64908Da,等电点在7.12～7.30之间,最适温度为41℃,最适pH为5.6～6.0,其理化性质适合用于B型红细胞的血型改造;为了确定高效、快速、温和的酶解条件,本文对酶解B型红细胞的工艺进行了优化.通过研究缓冲液对酶与红细胞结合的影响,确定了最佳酶解缓冲液为250mmol/L甘氨酸和3mmol/LNaCl,pH6.8;酶解的最适红细胞压积为40%,酶解温度为26℃,酶解时间为1h.利用优化的酶解工艺获得的B-ECORBCs形态及结构功能指标均正常,流式细胞结果证明其B抗原和H抗原标记率与O型红细胞相当,说明制备B-ECORBCs的工艺已成熟.这种工艺具有酶用量少、酶解条件温和、制备过程简单和时间短等优势,具有很好的临床应用前景.     

用于B→O血型改造的不同α-半乳糖苷酶的比较

α 半乳糖苷酶因可水解人B型红细胞表面的α 半乳糖残基 ,使B抗原结构变成O抗原结构 ,而成为B→O血型改造的工具酶 .对可能具有酶解B抗原活性的 3种α 半乳糖苷酶 ,即来源于大豆、咖啡豆和人的α 半乳糖苷酶的结构和功能进行了比较研究 .首先 ,利用序列分析工具对 3种酶蛋白的一级结构和特性进行了比较 ;随后 ,将编码大豆和人的α 半乳糖苷酶的cDNA克隆入毕赤酵母中进行表达 ,对筛选所得表达菌株进行诱导培养 ,并从培养上清中纯化重组的大豆和人α 半乳糖苷酶 ;分别测定大豆、咖啡豆和人α 半乳糖苷酶的生物化学性质以及它们的底物特异性 ;最后 ,以纯化的重组酶对人B型红细胞进行酶解 ,并测定酶解后红细胞的结构与功能 .结果表明 ,人源的α 半乳糖苷酶不适于酶解B抗原 ,而大豆来源的α 半乳糖苷酶不仅可作为B→O血型改造的工具酶 ,而且比咖啡豆来源的α 半乳糖苷酶更具优势     

热稳定型α-半乳糖苷酶的应用及基因工程研究进展

α-半乳糖苷酶是一种水解酶,可以将食品、饲料中的不良寡糖等抗营养因子水解,改变其营养成分并被动物吸收利用。该酶广泛存在于植物、动物及微生物中,在饲料、食品等工业以及现代医学中都有应用。目前,开发热稳定的α-半乳糖苷酶并利用基因工程方法进行分子改造和外源表达已成为研究热点。本文对近年来热稳定的α-半乳糖苷酶的应用和基因工程研究进展进行综述。     

微生物源α-半乳糖苷酶的研究进展

介绍了微生物源α-半乳糖苷酶的生理生化特性、合成调控机制的研究进展情况及其在食品、饲料、医药工业等领域的一些应用。Α-半乳糖苷酶均是糖蛋白,不同来源的α-半乳糖苷酶的作用基质特异性差别较大,作用基质特异性差别是由蛋白质部分N-末端氨基酸序列决定的。不同微生物来源的α-半乳糖苷酶其最佳作用条件、pH稳定性及耐热性差异较大。微生物α-半乳糖苷酶是一种诱导酶,其合成受多个基因的调控,高浓度的葡萄糖能抑制其合成。     

微生物α-半乳糖苷酶的研究进展

α-半乳糖苷酶在多种生物内广泛存在,微生物是目前α-半乳糖苷酶的主要来源。微生物α-半乳糖苷酶可按照底物特异性或序列同源性分类,在古菌、细菌和真菌中均存在,其性质与来源和家族有关,催化机理大多为构型保留机制,目前主要应用于食品与饲料工业,还可用于生物质降解和医药领域。展望了微生物α-半乳糖苷酶的研究趋势。本文对相关研究者具有一定的参考意义。     

一株产低温β-半乳糖苷酶微杆菌的筛选鉴定、产酶条件及其酶学特性

【背景】低温β-半乳糖苷酶能在低温下仍保持较高的乳糖水解活性,筛选酶学特性适合在牛乳体系中高效水解乳糖的β-半乳糖苷酶生产菌株,是低乳糖牛乳加工产业关注的焦点。【目的】对天山中国一号冰川沉积物中分离的一株产低温β-半乳糖苷酶菌株的产酶条件和酶学特性进行研究。【方法】结合X-Gal平板法初筛和测定粗酶液酶活复筛,获得产低温β-半乳糖苷酶的菌株。通过形态学、生理生化试验及16S rRNA基因测序分析对筛选菌株进行鉴定,单因素摇瓶实验优化菌株的产酶条件,硫酸铵分级沉淀初步纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行分析。【结果】通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因鉴定,确定菌株LW106为微杆菌属(Microbacterium)菌株;该菌株最适产酶温度为25°C,最佳产酶碳源为可溶性淀粉,培养基初始pH为7.0,接种量为3%;对初步纯化的低温β-半乳糖苷酶酶学性质的研究表明,LW106所产β-半乳糖苷酶的最适pH为6.0,最适反应温度为35°C,4°C时酶活为最大酶活的78%,4°C和pH 7.0时的稳定性最好,10 mmol/L的Na+对酶活性基本没有抑制作用,Ca~(2+)对酶活性具有一定的激活作用。【结论】菌株LW106所产低温β-半乳糖苷酶的酶学特性表明该酶在乳品低温加工领域具有进一步研究和应用的价值。     

表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型的建立及其在肿瘤DNA疫苗研究中的应用

本文工作的目的是建立以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型,并进行肿瘤免疫的研究。我们首先在pcDNA3质粒中引入一个β-半乳糖苷酶编码基因从而建立转染质粒p3gal。p3gal转染小鼠黑色素瘤细胞B16后,再通过G418筛选及X-Gal细胞染色得到表达β-半乳糖苷酶的gal B16细胞株。接着用该细胞株成功地在C57小鼠上建立了表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型。并在此模型上观察了β-半乳糖苷酶编码基因作为DNA疫苗抑制gal B16肿瘤生长的作用。     

香蕉果实软化相关β-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达分析

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）通过分解细胞壁半纤维素切除半乳糖键而参与果实软化。为了阐明香蕉（Musasp．）果实成熟过程中的软化与细胞壁代谢酶β-半乳糖苷酶基因表达之间的关系,采用RT-PCR方法,从成熟香蕉果实果肉中分离了编码β-半乳糖苷酶基因的部分cDNA（MA-Gal）,序列分析表明,MA-Gal包含927bp,编码309个氨基酸,包含5个β-半乳糖苷酶结构域（典型真核生物中β-半乳糖苷酶包含7个结构域）,推导的MA-Gal蛋白质中有β-半乳糖苷酶蛋白的催化活性部位GGPIILSQIENEY（F）;系统进化树分析结果表明MA-Gal属于第一类β-半乳糖苷酶基因（该类主要在果实中表达）;β-半乳糖苷酶活性和硬度的变化表明其与香蕉果实硬度变化密切相关;Northern分析显示,跃变前期的果肉中,MA-Gal基因的表达量很低,后随着果实的软化表达量不断增加,并在呼吸跃变后达到最高。所有结果表明,MA-Gal参与香蕉果实成熟过程中的软化。     

作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶(EmGalase)的鉴定和研究

对脑膜炎败血伊丽莎白金菌进行糖苷酶功能基因组分析发现,该菌存在一个GH27家族α-半乳糖苷酶基因。克隆该基因并表达蛋白后,利用人工合成的pNP底物研究其酶学性质,发现该酶具有α连接的半乳糖(α-galactose,α-Gal)底物特异性,酶反应pH为3.0~8.0,反应温度为4~45 ℃。用不同寡糖底物进一步确定,该酶能够酶切直链末端α-1,3、1,4、1,6Gal。在猪红细胞上进行的酶切实验显示,该酶能够高效清除存在于猪红细胞表面的末端Gal α 1-3Gal表位。末端α-半乳糖基化修饰在免疫与感染中发挥着重要的生物学作用,作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶的发现将为该领域的研究提供一个新的工具,为缓解异种输血中的超急性免疫排斥反应提供一种可能。     

共表达内质网响应蛋白HAC1对α-半乳糖苷酶在毕氏酵母中表达的影响

为提高毕氏酵母(Pichia pastoris)中重组α-半乳糖苷酶的表达,将来源于P.pastoris GS115的hac1基因构建至pPIC9K表达载体中,转化到重组P.pastoris中与α-半乳糖苷酶共表达。研究结果表明,在AOX1启动子控制下,HAC1过表达提高了重组P.pastoris中α-半乳糖苷酶蛋白表达含量,使α-半乳糖苷酶活性提高了2.2倍。经PCR产物鉴定,结果表明重组P.pastoris基因组中插入hac1基因。经50 L发酵罐甲醇诱导168 h,Gal-HAC1-4#工程菌最终酶活达到6 560 U/mL,比Gal-21#工程菌提高了27%。甲醇诱导后Gal-HAC1-4#发酵液中粗蛋白浓度均高于Gal-21#工程菌。表明共表达HAC1蛋白可提高毕氏酵母产α-半乳糖苷酶蛋白的能力。     

新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究

观察脆弱类杆菌来源的新型重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性.在有选择压力(Kan+)条件下,将重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、平板传代及诱导过程中的质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力检测.结果表明细菌形态、生长速度和抗生素抗性等与原始种子库无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100％,但诱导过程中质粒易丢失.第20、40和60代提取质粒进行酶切检查,酶切图谱没有改变.DNA测序未见α-半乳糖苷酶基因变异.原代菌株及第20、40和60代菌株经诱导培养,其α-半乳糖苷酶表达水平、酶活力及菌体蛋白的SDS-PAGE图谱均无明显差异.说明α-半乳糖苷酶工程菌株在平板传代中具有良好的遗传稳定性     

云南传统发酵豆豉中产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究

目的从云南豆豉样品中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌,并对其产酶条件进行研究。方法从云南省元阳、红河、建水、石屏等地采集豆豉样品,并从中分离得到355株微生物。结果经明胶诱导、脱脂乳平板实验,复筛得到87株蛋白酶产生菌,从中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌。通过X-Gal平板实验,共获得34株产β-半乳糖苷酶菌株,通过酶活测定,最终筛选得到1株高产β-半乳糖苷酶菌株GJ-1-3L,经16S rDNA序列分析鉴定为短乳杆菌;GJ-1-3L在以葡萄糖为碳源、多聚蛋白胨为氮源、起始pH 6.5的MRS培养基中,接种量为4%,35℃发酵培养12 h,其β-半乳糖苷酶活性高达6.73 U/mL,Cu2＋、Ba2＋对酶活有抑制作用,而K2HPO4、MgSO4则能促进酶活。结论 GJ-1-3L菌株来源于豆豉,能够产生β-半乳糖苷酶发酵乳糖,同时产生乳酸,其在食品与乳品加工等方面具有很好的应用前景。