维甲酸及其受体与肿瘤关系的研究进展

维甲酸(retinoic acid,RA)是维生素A的活性代谢产物,全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)、13-顺式维甲酸(13-cis-retinoic acid,13-cRA)和9-顺式维甲酸(9-cis-retinoic acid,9-cRA)等是其同分异构体。维甲酸通过与其受体包括维甲酸受体和维甲酸X受体结合调控靶基因表达,在胚胎发育和细胞的生长及分化过程中发挥重要作用。全反式维甲酸治疗急性早幼粒白血病开创了分子靶向药物诱导肿瘤细胞分化治疗的先河,目前研究发现,维甲酸及其受体与肿瘤细胞的分化、增殖或凋亡等密切相关。就维甲酸及其受体与肿瘤关系的研究进展进行综述,为进一步研究奠定基础。     

视黄醇结合蛋白RBP4可与多种核受体相互作用

视黄醇结合蛋白 (retinolbindingprotein ,RBP4 )是体内一种重要的转运蛋白 ,主要负责结合、转运全反式视黄醇 (维生素A ,VitA ) .VitA及其衍生物如11 cis 视黄醛、all trans 视黄酸等 ,均是体内非常重要的疏水分子 ,与视觉循环、胚胎发育等多种过程有关 .RBP4的功能障碍会导致     

W86F/W86A突变对细菌视紫红质光循环影响的差异性分析

细菌视紫红质(bacteriorhodopsin,bR)是一种光驱受体蛋白,每个活性单元由3个单体组成,每个单体由一分子视蛋白和一分子的视黄醛发色团共价结合而成,其功能为从胞内向胞外定向传输质子,利用形成的质子浓度梯度将光能转化为化学能.光照后视黄醛发色团构型发生all-trans向13-cis转变,蛋白的构象也随之发生了一系列具有稳定中间态的变化并驱动质子的定向传递.为探讨bR视黄醛键合区保守性氨基酸色氨酸86 (Tryptop-han86,w86)对其光循环中间态和质子泵功能的影响,本研究采用定点突变技术将W86突变为侧链大小不同的F86和A86,通过原位紫外-可见光吸收光谱、闪光光解光谱、pH滴定、固体核磁共振等技术手段,探究W86F和W86A突变对bR光循环及质子泵功能影响差异性的分子机制.结果 表明,W86F和W86A突变均造成了bR暗适应状态下视黄醛顺反异构平衡向顺式构型占优的方向移动,且W86F突变可造成反式构型的完全消失.此外,无论是W86F还是W86A突变都造成了蛋白光循环中间态的减弱且衰减延长,以及质子泵功能减弱,但影响机制各有所不同,这可能与这两个突变对视黄醛多烯链上电子云的分布以及周围残基造成的扰动程度不同有关.     

CYP19基因表达与芳香化酶活性调控因子的研究进展

芳香化酶是雌激素合成中的关键酶,催化睾酮和雄烯二酮转化为雌激素。本文在对芳香化酶的蛋白结构、基因特征和分布进行阐述的基础上,重点对编码该蛋白的CYP19基因的调控因子以及芳香化酶活性的调节进行探讨。CYP19基因的调控因子包括cAMP反应元件(CRE)、类固醇生成因子1/肾上腺4结合蛋白(SF-1/Ad4BP)、雌激素受体(ER)等顺式作用因子和TATA结合蛋白(TBP)、生长因子等反式作用因子。主要通过cAMP依赖性蛋白激酶信号通路在转录水平对其进行调节。而芳香化酶表达及其酶活性的调控因子主要集中于性类固醇激素和促性腺激素,此外还受到温度等外部因子等因素的调节。芳香化酶的调节对维持雌雄激素间作用的平衡、保证机体的正常生理功能具有重要意义。     

脱氢表雄酮对高脂诱导的兔主动脉及人脐静脉内皮细胞VCAM-1表达的影响

目的探讨脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)对高脂诱导的血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响,以及全反式维甲酸在这一过程中的作用。方法细胞实验:将培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical ve-nous endothelial cells,HUVEC)分为6组:1.正常对照组;2.ox-LDL组;3.ox-LDL DHEA(低浓度)组;4.ox-LDL DHEA(高浓度)组;5.ox-LDL DHEA 全反式维甲酸组;6.DHEA组。各组均用相应药物作用24h,采用逆转录聚合酶链反应和ELISA法检测各组细胞VCAM-1 mRNA及蛋白的表达情况。动物实验:将大耳白兔分为5组:1.正常对照组;2.高脂组;3.高脂 DHEA组;4.高脂 DHEA 全反式维甲酸组;5.单DHEA组。各组白兔均用相应饲料喂饲2个月后,处死动物。采用逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学等方法检测各组白兔主动脉VCAM-1 mRNA及蛋白的表达情况。结果细胞实验:①ox-LDL组VCAM-1的表达明显高于正常对照组(P<0.01)。②与ox-LDL组相比ox-LDL DHEA组VCAM-1的表达明显降低(P<0.01),并呈现浓度依赖性的特点(P<0.05)。动物实验:①高脂组主动脉VCAM-1的表达明显高于正常对照组(P<0.05)。②与高脂组相比高脂 DHEA组VCAM-1的表达明显降低(P<0.05)。结论DHEA能够抑制高脂诱导的VCAM-1的表达。这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。而全反式维甲酸对DHEA的这一作用并无明显增强作用。     

不同pH条件下细菌视紫红质的共振拉曼光谱研究

本实验测定了不同pH条件下嗜盐菌紫膜中细菌视紫红质(bR)的共振拉曼光谱.13-顺式视黄醛生色团的特征峰1187cm~(-1)和全反式、13-顺式共有的特征峰1200cm~(-1)带强度之比I_(1187)/I_(1200)在pH1.0-8.9之间约为0.76,而pH高于8.9为0.97.pH3.0-9.0时C=NH~ 振动峰为1640-1642cm~(-1),pH9.4以上为1642-1644cm~(-1),pH9.2附近变化最大,pH3.0以下低于1640cm~(-1).酸性和弱碱性范围时,19-CH_3和20-CH_3的面内变形振动与面外变形振动相互重叠,碱性范围分为双峰.并讨论了对结构及其稳定性的影响.     

不同视觉经验中zif268基因的表达模式

zif268基因编码一转录因子ZIF268. 在发育的视皮层中,zif268基因的表达模式受发育的调节. 在具有正常视觉经验的视皮层中,zif268基因有较高水平的表达. 视觉废置后,视皮层内该基因的表达水平显著降低. 通过视觉刺激可显著增强该基因的表达. 有关zif268基因表达模式的研究对于阐明该基因在哺乳动物视觉系统中的生理功能起到借鉴的作用.     

二聚体蝎钠通道毒素的1.4Å分辨率晶体结构：反常非脯氨酸顺式肽键及其内在结构因素

报道了以二聚体存在的dimo-BmK M1的1.4Å分辨率晶体结构. 蛋白质中的肽键是局部双键,不可旋转,因此具有顺式 (cis) 和反式 (trans) 两种构型,它们不能通过旋转操作相互转换. 非脯氨酸顺式肽键是指形成该肽键的氨基是由脯氨酸以外的氨基酸提供的 (Xaa-nonPro),这类肽键的顺式构型的自由能远比反式高,因此极少出现在天然蛋白质结构中. 事实上,在长时间中,多肽链的“反式肽键连接”被视为蛋白质结构的一条基本规则,把顺式肽键视为不可能. 随着高分辨率精确蛋白质结构数量的增加,近年来有详细的统计分析揭示,非脯氨酸顺式肽键 (Xaa-nPro) 在蛋白质结构中出现的几率为0.03%～0.05%,而且大多存在于功能敏感的结构区域,可能具有重要意义. 但由于所用的基本结构数据都来自晶体结构,对这种反常肽键是否由结晶环境影响而形成,存在疑问. 此前曾在以单体形式存在的蝎神经毒素mono-BmK M1的高分辨率结构中发现其中肽键Pro9-His10是非脯氨酸顺式肽键,并详细分析了其结构-功能意义. 以二聚体存在的dimo-BmK M1的1.4Å分辨率晶体结构表明,它与mono-BmK M1有不同的空间群、不同的分子堆积方式,不同的晶体环境. 结构模型被高度精化, R_cryst达到0.109. dimo-BmK M1结构显示,在不对称单位中的两个M1分子在同一位置 (残基9-10之间) 都清晰地存在顺式肽键. 立体化学分析显示,这一肽键的几何参数和局部结构与mono-BmK M1中的 (9-10) 顺式肽键基本相同. 这一结果表明,非脯氨酸顺式肽键9-10的存在与结晶环境无关,是BmK M1分子的固有结构特征. 在此基础上,综合分析了与顺式、反式肽键相关的结构元素,发现与残基 (8-19) 序列模体-KPXNC- (X为任意氨基酸) 所决定的特征回折结构可能是分子内在的主要结构因素,其中第8位残基是Lys或Asp对决定肽键是顺式还是反式有关键作用. 近来的突变实验及其晶体结构测定已证实,Lys8/Asp8是 (9-10) 肽键顺式/反式异构的结构开关,它们对该类分子与不同种属钠通道作用的专一选择性具有重要作用. 通过BLAST搜索,发现在其他18个蛋白质中也存在相同的序列模体-KPXNC-,推测在这些蛋白质的相应肽键位置也可能存在反常的脯氨酸顺式肽键.     

二聚体蝎钠通道毒素的1.4 分辨率晶体结构:反常非脯氨酸顺式肽键及其内在结构因素(英文)

报道了以二聚体存在的dimo-BmKM1的1.4!分辨率晶体结构.蛋白质中的肽键是局部双键,不可旋转,因此具有顺式(cis)和反式(trans)两种构型,它们不能通过旋转操作相互转换.非脯氨酸顺式肽键是指形成该肽键的氨基是由脯氨酸以外的氨基酸提供的(Xaa-nonPro),这类肽键的顺式构型的自由能远比反式高,因此极少出现在天然蛋白质结构中.事实上,在长时间中,多肽链的“反式肽键连接”被视为蛋白质结构的一条基本规则,把顺式肽键视为不可能.随着高分辨率精确蛋白质结构数量的增加,近年来有详细的统计分析揭示,非脯氨酸顺式肽键(Xaa-nPro)在蛋白质结构中出现的几率为0.03%～0.05%,而且大多存在于功能敏感的结构区域,可能具有重要意义.但由于所用的基本结构数据都来自晶体结构,对这种反常肽键是否由结晶环境影响而形成,存在疑问.此前曾在以单体形式存在的蝎神经毒素mono-BmKM1的高分辨率结构中发现其中肽键Pro9-His10是非脯氨酸顺式肽键,并详细分析了其结构-功能意义.以二聚体存在的dimo-BmKM1的1.4"分辨率晶体结构表明,它与mono-BmKM1有不同的空间群、不同的分子堆积方式,不同的晶体环境.结构模型被高度精化,Rcryst达到0.109.dimo-BmKM1结构显示,在不对称单位中的两个M1分子在同一位置(残基9-10之间)都清晰地存在顺式肽键.立体化学分析显示,这一肽键的几何参数和局部结构与mono-BmKM1中的(9-10)顺式肽键基本相同.这一结果表明,非脯氨酸顺式肽键9-10的存在与结晶环境无关,是BmKM1分子的固有结构特征.在此基础上,综合分析了与顺式、反式肽键相关的结构元素,发现与残基(8-19)序列模体-KPXNC-(X为任意氨基酸)所决定的特征回折结构可能是分子内在的主要结构因素,其中第8位残基是Lys或Asp对决定肽键是顺式还是反式有关键作用.近来的突变实验及其晶体结构测定已证实,Lys8/Asp8是(9-10)肽键顺式/反式异构的结构开关,它们对该类分子与不同种属钠通道作用的专一选择性具有重要作用.通过BLAST搜索,发现在其他18个蛋白质中也存在相同的序列模体-KPXNC-,推测在这些蛋白质的相应肽键位置也可能存在反常的脯氨酸顺式肽键.     

藻蓝蛋白联合全反式维甲酸对HeLa细胞生长抑制作用的研究(英文)

目的:探讨全反式维甲酸和藻蓝蛋白单独及联合用药对HeLa细胞生长的影响,并揭示两者联合用药对细胞周期和细胞凋亡影响的分子机制。方法:MTT法检测全反式维甲酸和藻蓝蛋白单独及联合用药对HeLa细胞生长的影响,原位杂交法检测用药前后细胞内CDK-4基因mRNA的表达情况,免疫组化法检测用药前后bcl-2基因的表达情况,TUNEL法检测用药前后细胞凋亡情况。结果:全反式维甲酸和藻蓝蛋白均具有抑制HeLa细胞生长的作用,当达到相同的抑制率时,联合藻蓝蛋白使用可以显著降低全反式维甲酸的使用剂量从而达到降低毒副作用的目的。两者联合用药可以显著降低CDK-4的表达量从而对HeLa细胞的细胞周期产生影响。两者联合用药可以显著下调bcl-2的表达水平从而引发细胞凋亡。结论:通过联合藻蓝蛋白,可以显著降低全反式维甲酸的使用剂量从而降低毒副作用。全反式维甲酸和藻蓝蛋白联合用药抑制HeLa细胞生长的分子机制可能是通过抑制CDK-4和bcl-2的表达来影响细胞周期并最终导致细胞凋亡。     

一种新的短链脱氢/还原酶家族新成员:NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因的克隆和分析

从牛的肝脏中快速抽提总RNA,根据GenBank已发表NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因(NRDR)的cDNA序列,设计并合成特异引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),得到牛肝内的NRDR cDNA的全长序列。经测序证实,牛肝NRDR的全长cDNA序列为1266bp,其开放读码框架在24～806bp,编码260个氨基酸(GenBank登录号：AF487454)。根据NRDR基因推导出的氨基酸序列与人、鼠、兔有高度同源性,并含有SDR超家族成员的两个高度保守的模序,在其C-端含有过氧化物酶体的靶向序列为SHL。结果表明,牛的NRDR应属于过氧化物酶体内SDR超家族成员并在维甲酸合成的限速步骤起作用的酶,也为维甲酸合成的传统通路提供一个补充。     

一种人肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢酶剪接体cDNA的克隆及特征分析

在用RT-PCR法局部扩增人与小鼠肝脏635bp的NRDR DNA时,在人肝中发现了另一短序列PCR产物,克隆后测序显示其整个序列与NRDR cDNA编码区的前后序列完全一致。采用3’-Race和5’-Race方法,从人肝组织细胞中扩增得到两个全长cDNA,除1261bp的NRDR cDNA外,另一个为全长1003bp、编码区长为525bp的NRDRiso(GenBank登录号：AY071856)。数据库分析表明,NRDRiso编码区是由人NRDR8个外显子中的第1、2、3、7、8外显子选择性剪接而成。缺失的NRDR第4、5、6外显子共258bp,编码86个氨基酸。因此,与人NRDR的260个氨基酸残基相比,NRDRiso由174个氨基酸残基组成,分子量为18．6kDa,并且NRDRiso的组织表达与NRDR明显不同。     

茶树肌动蛋白基因（CsActin1）全长cDNA克隆与生物信息学分析

以茶树（Camellia sinensis）萌动芽为材料,根据茶树萌动芽芽抑制消减杂交文库中分离得到的肌动蛋白（actin）基因的5′-片段设计引物,利用3′-RACE技术克隆了其cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 470 bp,命名为CsActin1（GenBank登录号HQ235647）。序列分析表明,CsActin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区100 bp,3′非编码区236 bp。推测的蛋白质分子量为41.70 kD,等电点约为5.31,具有肌动蛋白家族的特征信号序列（YVGDEAQs.KRG和WIAKaEYDE）和肌动蛋白相关蛋白的特征信号序列（LLTEApLNPkaNR）。CsActin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在80%以上,氨基酸序列相似性在95%以上。与其它植物肌动蛋白的进化树分析结果表明,茶树肌动蛋白与杨树的两个肌动蛋白间的亲缘关系最为密切。并对推导的蛋白结构进行了分析。     

Characterization of the D-glucuronyl C5-epimerase involved in the biosynthesis of heparin and heparan sulfate

The murine gene for the glucuronyl C5-epimerase involved in heparan sulfate biosynthesis was cloned, using a previously isolated bovine lung cDNA fragment (Li, J.-P., Hagner-McWhirter, A., Kjellén, L., Palgi, J., Jalkanen, M., and Lindahl, U. (1997) J. Biol. Chem. 272, 28158-28163) as probe. The approximately 11-kilobase pair mouse gene contains 3 exons from the first ATG to stop codon and is localized to chromosome 9. Southern analysis of the genomic DNA and chromosome mapping suggested the occurrence of a single epimerase gene. Based on the genomic sequence, a mouse liver cDNA was isolated that encodes a 618-amino acid residue protein, thus extending by 174 N-terminal residues the sequence deduced from the (incomplete) bovine cDNA. Comparison of murine, bovine, and human epimerase cDNA structures indicated 96-99% identity at the amino acid level. A cDNA identical to the mouse liver species was demonstrated in mouse mast cells committed to heparin biosynthesis. These findings suggest that the iduronic acid residues in heparin and heparan sulfate, despite different structural contexts, are generated by the same C5-epimerase enzyme. The catalytic activity of the recombinant full-length mouse liver epimerase, expressed in insect cells, was found to be >2 orders of magnitude higher than that of the previously cloned, smaller bovine recombinant protein. The approximately 52-kDa, similarly highly active, enzyme originally purified from bovine liver (Campbell, P., Hannesson, H. H., Sandb?ck, D., Rodén, L., Lindahl, U., and Li, J.-P. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26953-26958) was found to be associated with an approximately 22-kDa peptide generated by a single proteolytic cleavage of the full-sized protein.     

人牛精浆蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达

为了研究牛精浆 (bovineseminalplasma ,BSP)蛋白及其相关蛋白在受精及受精卵发育中的重要作用 ,寻找BSP蛋白相关新基因 .采用cDNA末端快速扩增 (RACE)技术 ,克隆了一个BSP蛋白相关基因的cDNA序列 .应用辐射杂种细胞系 (RH)技术进行了基因染色体定位 .通过RT PCR检测了该基因在人体各组织中的表达情况 .并将该基因编码的蛋白进行了原核表达 .新基因的cDNA长度为 10 5 2bp ,其开放阅读框架 (ORF)编码了一个含 2 2 3个氨基酸残基的蛋白质 ,氨基酸序列中含有 4个纤连蛋白Ⅱ结构域 ,与BSP蛋白在结构上具有一定的相似性 ,称其为人BSP相关蛋白 (humanBSP relatedproteins ,HBRP) .该基因定位于染色体 19q13,在大肠杆菌中表达为 5 2kD的融合蛋白 .研究结果提示 ,应用RACE方法克隆了一种新的人类与BSP蛋白相关的基因 ,推测其编码蛋白是与BSP蛋白功能相关的结合蛋白 ,通过基因重组技术大量获得表达蛋白 ,对进一步研究新蛋白的生物学功能具有重要的意义 .     

Cloning and expression of cDNA encoding hamster liver 3-hydroxyhexobarbital/17β(3α)-hydroxysteroid dehydrogenase 1

Using RACE techniques we have cloned and sequenced one of the hamster liver 3-hydroxy-hexobarbital dehydrogenases which catalyze not only cyclic alcohols but also 17β-hydroxy-steroids and 3α-hydroxysteroids. The gene specific primers to 3-hydroxyhexobarbital dehydrogenase 1 (G2) were synthesized on the basis of its partial peptide sequences. The sequence of full length cDNA generated by 3′- and 5′-RACE PCR consisted of 1225 nucleotides including an open reading frame of 972 nucleotides encoding a protein of 323 amino acids. The deduced amino acid sequence matched exactly with the partial peptide sequences of hamster liver 3-hydroxyhexobarbital dehydrogenase 1 (G2). The sequence showed 84.5% identity to mouse liver 17β-dehydrogenase(A-specific), and 74–76% identity to human liver bile acid binding protein/3α-hydroxysteroid dehydrogenase (DD2), human liver 3α-hydroxysteroid dehydrogenase type I (DD4) and type II (DD3), and rabbit ovary 20α-hydroxysteroid dehydrogenase. The protein contains catalytic residues of aldo-keto reductases, Asp50, Tyr55, Lys84, His117. These results suggest that the hamster liver 3-hydroxyhexobarbital/17β(3α)-hydroxysteroid dehydrogenase belongs to aldo-keto reductase superfamily. The insert containing the full-length cDNA of 3-hydroxyhexobarbital dehydrogenase and vector specific overhang produced by PCR was annealed with pET-32 Xa/LIC vector. The plasmid was transformed into BL21 (DE3) cells containing pLysS. The recombinant enzyme was induced 1 mM IPTG. The expressed enzyme was produced as fusion protein and purified by nickel chelating affinity chromatography followed by POROS CM column chromatography and superdex 75 gel filtration. Molecular weight of the recombinant enzyme fused thioredoxin and his•tag was about 55 000 and that was 35 000 after Factor Xa protease treatment. The recombinant enzyme dehydrogenated 3-hydroxy-hexobarbital, 1-acenaphthenol, 2-cyclohexen-1-ol, testosterone, glycolithocholic acid as well as the native enzyme purified from hamster liver.     

乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA的克隆与表达

目的:克隆编码人Ⅰ类乙醇脱氢酶基因,并探讨Ⅰ类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中的作用。方法:从胎儿肝,肾提取的总RNA;经RT-PCR扩增得到cDNA并克隆至pGEM-T载体。cDNA序列用Kpn I和Pst I酶切鉴定,并检测其在大肠杆菌中表达活性。通过吸光法检测酶的活性。结果:成功克隆了人Ⅰ类乙醇脱氢酶并在大肠杆菌中获得稳定表达。经检测其酶活性分别为0．81～1．31U/mg、0．09～0．15U/mg和0．76～1．11U/mg。结论:cDNA克隆成功,并发现其与肝脏中分离的酶具有相似的活性。     

NRDRiso酶cDNA的序列测定及生物信息学分析

通过鉴定分析人肝组织中辅酶II依赖性视黄醇脱氢酶不同剪接体全长cDNA核苷酸序列与氨基酸序列的结构特征,为今后进一步研究体内维甲酸的代谢情况奠定基础。根据人、小鼠NRDR编码区的一致性序列,设计一对引物,应用RTPCR方法从人肝组织中得到一条377bp的新的cDNA片段。采用RACE法得到了NRDR新亚型cDNA,并以生物信息学软件分析其生物学特征。 测序得知该cDNA长为1003bp,以NADP-dependent retinol dehydrogenase/reductase short isoform（NRDRiso）登录GenBank。其读码框为525bp,拟编码174个氨基酸的蛋白。