高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤对程序性坏死的影响及其机制*

目的: 探讨程序性坏死在高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤中的变化及可能机制。方法: 原代大鼠心肌细胞随机分为4组(n=9):正常对照组(Control,5.5 mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48 h)、高糖组(HG,30 mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48 h)、HG+Nec-1(30 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L程序性坏死关键蛋白RIP1抑制剂Nec-1共同培养心肌细胞48 h)组、高渗组(HPG,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇共同培养心肌细胞48 h)。MTT法检测各组心肌细胞活力,DHE荧光染色检测细胞氧化应激水平,ELISA法检测心肌细胞TNF-α、IL-6及IL-1β水平,Real-time PCR和Western blot分别检测各组程序性坏死关键蛋白RIP1、RIP3、MLKL mRNA和蛋白水平的表达情况。结果: 与Control组相比,HG组心肌细胞活力明显降低(P＜0.01),氧化应激水平明显增高(P＜0.01),TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高明显(P＜0.01),RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白水平表达均明显升高(P＜0.05);与HG组相比,HG+Nec-1组心肌细胞活力明显升高(P＜0.01),氧化应激水平明显下降(P＜0.01),TNF-α、IL-6及 IL-1β水平明显降低(P＜0.01), RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白水平表达均下降(P＜0.05)。结论: 高糖诱导的原代大鼠心肌细胞损伤可引起程序性坏死的发生;抑制程序性坏死可减轻细胞损伤的机制,可能与抑制氧化应激、减轻炎症反应有关。     

银杏内酯B和低氧预适应对小鼠急性缺氧损伤的保护作用

目的：通过观察缺氧预适应和银杏内酯B预处理对小鼠急性缺氧的影响,了解银杏内酯B的脑保护作用。方法：采用小鼠常压缺氧模型,观察小鼠的行为学并记录各组小鼠的最后死亡时间,脑组织含水量,用RT-PCR、Western blot分别检测各组小鼠皮层组织中RTP801mRNA表达和EPO蛋白表达。结果：银杏内酯B和低氧预适应均能明显延长常压缺氧小鼠的存活时间,降低脑水肿程度,并且银杏内酯组和低氧预适应组RTP801mRNA表达和EPO的表达均明显增加。结论：银杏内酯B与低氧预适应具有相类似的对抗小鼠急性低氧的作用,其脑保护作用与上调RTPS01mRNA和EPO蛋白的表达有关。     

胞浆识别受体NODs及其信号通路在侵袭性肺曲霉病中的作用

【目的】研究天然免疫系统中胞浆识别受体NODs及其信号通路在小鼠侵袭性肺曲霉病(IPA)中的作用。【方法】小鼠随机分为正常对照组、正常+接种烟曲霉菌组(正常感染组)和免疫抑制+接种烟曲霉菌组(IPA组),经鼻吸入烟曲霉孢子后在不同时相点处死小鼠,无菌取肺组织分别进行病理切片,烟曲霉菌落计数,RT-PCR法、Western blot法动态检测小鼠感染烟曲霉菌过程中肺组织NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表达,促炎细胞因子TNF-α含量的变化规律。【结果】鼻吸入烟曲霉菌后72 h时,IPA组肺组织出现严重炎症反应,并有大量的菌丝生成,同时各时相点的烟曲霉菌负荷均高于正常感染组;与正常感染组比较,IPA组NOD1、RIP2 mRNA持续低表达,而NOD2 mRNA则在感染最早期(24 h)异常高表达,而在随后的感染过程中一直处于低表达状态;正常小鼠感染烟曲霉菌后,肺组织中促炎细胞因子TNF-α在感染前期皆呈高表达,且最高表达量均出现在48 h或72 h,之后下降并恢复至正常水平。而IPA小鼠促炎症细胞因子TNF-α缓慢且低水平释放。【结论】NOD1、RIP2的表达受到长期抑制,NOD2在感染最早期的过度激活以及随后的抑制表达,引起促炎细胞因子低表达,可能导致了侵袭性肺曲霉的发生发展。     

心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用。方法Western blot检测小鼠NOL3表达谱。构建aMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠。PCR鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型。结果NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变。通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加。单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化。结论成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。     

miR-30b 的组织特异性研究

目的:研究miR-30b的组织特异性,检测其在心,肝,脑,肾,脾和骨骼肌中的表达情况。方法:选取C57BL/6J雄性小鼠6只,用real-time PCR方法检测小鼠心,肝,脑,肾,脾和骨骼肌中miR-30b的表达量。结果:miR-30b在小鼠肝脏中表达量最低,与肝相比,在心,脑,肾,脾和骨骼肌中的相对表达量分别为13.13±0.899,9.497±0.717,4.478±1.031,6.751±0.596,2.538±0.79。且与肝相比均具有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-30b在各组织中的表达存在差异,在心脏中的表达量最高,提示miR-30b可能与心脏的发生发展密切相关,为深入探索miR-30b的功能奠定了基础。     

七种Mg2+转运体在出生后不同时期小鼠心肌细胞的表达

目的:研究小鼠心肌细胞上七种Mg2+转运体mRNA在不同发育时期的表达情况.方法:提取不同发育时期小鼠心脏组织mRNA,用七对Mg2+转运体特异性引物进行RT-PCR扩增,经凝胶成像仪进行凝胶荧光定量检测.结果:经RT-PCR半定量检测后,观察到小鼠心肌细胞上七种转运体mRNA在不同时期都有不同程度的表达,其中TRPM7和MagT1两种转运蛋白在各个时期表达较稳定,并且表达量明显高于其他五种Mg2+转运体.结论:TRPM7和MagT1在小鼠心肌细胞不同发育时期Mg2+调控过程中可能发挥主导作用.     

神经特异性转录因子DAT1基因的表达

采用生物信息学分析、细胞培养和RT—PCR等方法,以初步解DAT1基因在小鼠主要组织及神经系统相关肿瘤细胞中的表达．生物信息学的基因表达谱分析发现与DAT1同源的EST有100多条,大多数EST分布于胎脑、成年脑、脑肿瘤、肺及肺部的良性肿瘤等组织．SAGE分析发现DAT1在脑及神经系统肿瘤组织中表达非常广泛;RT—PCR方法检测发现DAT1只在脑组织中特异表达。而其它组织如心脏、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、睾丸、卵巢等未见表达;DAT1在培养的正常星形胶质细胞C8中不表达,在胶质瘤、神经母细胞瘤等细胞株中有不同水平的表达．由于DAT1是一种LIM蛋白,而LIM蛋白在细胞的分化、发育调控和肿瘤形成中有重要作用,DAT1在脑及神经系统相关肿瘤中的较高表达提示,DAT1在神经系统中有重要功能。并可能与神经系统肿瘤的发生相关．     

心脏特异表达人源FAM55A转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为研究该基因在心肌病发病中的作用提供模型。方法 Western blot检测FAM55A在野生型小鼠与cTnTR141W转基因小鼠心脏组织中的表达变化及其在野生小鼠的组织表达谱。克隆人源FAM55A基因入α-MHC启动子下游构建a-MHC-FAM55A表达载体,显微注射法建立FAM55A转基因小鼠。PCR鉴定转基因首建鼠的基因型。Western blot鉴定人源FAM55A在转基因小鼠心脏中的表达,超声检测转基因小鼠心脏的几何构型和功能。HE染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 FAM55A在野生型小鼠心脏中有少量表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达增加。建立了1个心脏组织特异表达人源FAM55A转基因小鼠品系。与野生型小鼠相比,FAM55A转基因小鼠的心脏收缩期和舒张期左室前壁从1月龄到5月龄持续增厚,3月龄转基因小鼠心脏射血分数和短轴缩短率稍有增强,1月龄和5月龄转基因小鼠心脏功能则与同龄野生型小鼠相比无变化。组织学检测显示,转基因小鼠心脏左室心肌细胞不均匀肥大,但不发生紊乱。结论 FAM55A在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达上调,建立了心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。     

SENP1在大鼠低氧性肺动脉高压形成中肺血管壁中表达及可能作用

目的:探讨大鼠低氧性肺动脉高压(HPH)形成过程中SENP1在肺小动脉的动态表达变化及作用。方法:40只成年雄性Wistar大鼠随机分为5组(n=8):对照组和缺氧3 d、7 d、14 d2、1 d组,常压间断低氧复制HPH大鼠模型。测各组大鼠平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥大指数(RVHI)、血管形态学指标;原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺内SUMO特异性蛋白酶-1(SUMO-specific proteases-1,SENP1)mRNA表达,免疫组化、Westernblot检测其蛋白质水平。结果:①缺氧7 d后,肺小动脉出现血管重塑,且mPAP明显上升;低氧14 d后,肺小动脉重塑更明显,mPAP达高峰。RVHI在低氧14 d后明显增加。②原位杂交显示,SENP1 mRNA在对照组肺小动脉壁呈阳性表达,低氧后其相对量无明显变化。RT-PCR显示肺组织SENP1 mRNA表达与原位杂交所观察到的肺小动脉壁SENP1 mRNA变化趋势一致;SENP1蛋白在对照组呈阳性表达,低氧7 d后其表达量开始呈进行性下降。Western blot显示肺组织内SENP1蛋白表达与免疫组化观察到的肺小动脉壁SENP1蛋白变化趋势一致。③SENP1蛋白与mPAP、重塑指数、RVHI均呈负相关。结论:慢性低氧诱导肺小动脉壁SENP1蛋白降解,进而可能在HPH发病过程中发挥一定的作用。     

GDP在体外对大鼠脑线粒体脱耦联蛋白活性和表达的影响

本研究通过GDP体外处理大鼠脑组织块,观察GDP对脑线粒体脱耦联蛋白(uncoupling proteins,UCPs)活性、UCP4和UCP5表达的影响,以探讨嘌呤核苷酸对大鼠脑UCPs的调节作用.取Sprague-Dawley大鼠双侧大脑半球,将脑组织切成约8-10 mm3的脑组织块,与含1 mmol/L GDP的孵育介质共孵育30 min后,匀浆并差速离心分离提取大鼠脑组织线粒体,采用[3H]-GTP结合法测定UCPs活性,并以Scatehard作图法计算两者结合的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax);RT-PCR和Western blot分别检测UCP4和UCP5的mRNA和蛋白表达.结果显示,1 mmol/L GDP可降低体外大鼠脑组织线粒体中UCPs与[3H]-GTP结合的Bmax,提高Kd,但对脑纰织中UCP4和UCP5 mRNA和蛋白表达量的改变无统计学意义.上述结果提示,GDP可直接抑制体外大鼠脑组织中UCPs的活性,但并不影响UCP4和UCP5的表达.     

Gas8蛋白的抗体制备及小鼠组织表达图谱分析

目的：制备Gas8抗体,并检测小鼠各组织中Gas8表达谱。方法：在大肠杆菌BL21（DE3）中表达His标签标记的Gas8融合蛋白,以纯化的Gas8重组融合蛋白为抗原制备兔Gas8多抗血清,进一步利用亲和纯化方法制备Gas8多克隆抗体;为确定Gas8抗体的特异性,通过免疫印迹方法检测瞬时表达的Flag-Gas8融合蛋白,同时以抗Flag单克隆抗体作为对照;利用制备的抗体通过Westernblot检测Gas8在小鼠各组织中的表达谱。结果：与Gas8特异性结合的抗体能够通过免疫法获得;利用制备的抗体检测到Gas8在小鼠心、肺、肾、脑、肝、脾、肌肉、睾丸各组织中均表达。结论：获得了特异性抗Gas8抗体,用该抗体可以检测到小鼠组织中Gas8的表达。     

RIP3在淋巴瘤患者病理组织中的表达

目的：探讨RIP3（受体相互作用蛋白-3）在淋巴瘤患者病理组织中是否表达及其亚细胞定位,并初步观察RIP3的表达是否与淋巴瘤病理恶性度相关。方法：（1）利用免疫组化技术检测48例淋巴瘤和非肿瘤侵润淋巴结病理组织中RIP3表达,并观察RIP3亚细胞定位。结果：（1）RIP3在淋巴瘤患者病理组织中均有表达,其亚细胞定位主要在细胞核,在细胞质中相对弱表达。（2）RIP3表达与淋巴瘤病理恶性度可能存在相关性。结论：RIP3在淋巴瘤患者病理组织中存在阳性表达,为研究RIP3是否与淋巴瘤的发病、临床表现和预后相关,提供了新的探索途径：     

谷氨酰胺：6-磷酸果糖酰胺基转移酶多克隆抗体的制备及应用

目的：采用原核表达系统表达和纯化重组谷氨酰胺：6-磷酸果糖酰胺基转移酶（GFAT）,制备GFAT多克隆抗体,并用以研究在糖尿病发生发展过程中GFAT的表达情况。方法：通过生物信息学分析其抗原性和属间同源性,选择需要的基因区域;利用RT-PCR扩增小鼠肝脏cDNA中GFAT基因片段,克隆到表达载体pET28b中;在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,并用镍离子螯合柱（Ni-NTA）纯化重组GFAT;用纯化的重组GFAT免疫BALB／c小鼠后得到多克隆抗体;用Western印迹检测正常小鼠、高血糖小鼠及胰岛素抵抗小鼠的组织GFAT的表达。结果：Western印迹分析表明,制备的GFAT抗体具有较高的特异性,可特异性识别重组GFAT和正常小鼠肝脏、肾脏、骨骼肌和肺组织的GFAT;与正常小鼠相比,高脂饲料诱导的胰岛素抵抗小鼠肌肉组织的GFAT表达升高约1．8倍,肝脏组织则略有升高;高血糖小鼠肌肉组织和肝脏组织的GFAT表达也略有上升,但无统计学差异。结论：利用原核表达及Ni-NTA纯化系统可制备小鼠GFAT多克隆抗体;正常小鼠骨骼肌GFAT表达较高;肌肉组织的GFAT表达在胰岛素抵抗小鼠显著性升高,而与小鼠血糖水平无明显相关性。     

经鼻滴入博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的建立及其病理演变

目的经鼻快速滴入博莱霉素复制小鼠肺纤维化模型,观察肺纤维化模型小鼠的病理形态学改变及其羟脯氨酸含量变化,鉴定肺纤维化模型的成功建立。方法经鼻滴入博莱霉素建立小鼠肺纤维化模型。分别于造模第14天和第28天后,取肺组织行HE染色和天狼猩红染色,取心、肝、脾、肾、脑组织行HE染色,光镜下观察组织病理学变化;造模第28天后用样本碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸（HYP）的含量。结果①肺组织病理形态学改变：造模第14天和第28天后模型组小鼠肺泡炎及纤维化程度均明显高于阴性对照组,并且在造模第28天后肺纤维化程度进一步加重;②肺组织中HYP含量：与阴性对照组比较,模型组显著升高（P〈0.05）。结论经鼻滴入博莱霉素可以成功复制小鼠肺纤维化模型,肺纤维化模型小鼠HYP含量升高。     

大鼠心肌梗死后差异蛋白质组学分析

目的：建立大鼠心肌梗死后蛋白表达变化谱,以进一步了解心肌梗死后心肌细胞重塑产生机制。方法：通过结扎大鼠冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型,利用蛋白质双向凝胶电泳技术（two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）分离心肌总蛋白,采用PDQuest7.3.1软件比较分析,获得差异表达蛋白总体变化趋势。进一步通过蛋白免疫印记技术（Western-blotting）检测碱性成纤维生长因子（Basefibroblastgrowthfactor,bFGF）在心肌梗死后的表达变化。结果：成功建立了大鼠急性心肌梗死模型;2-DE结果表明：以假结扎组为对照,梗死3天组有27个蛋白显著上调,18个蛋白显著下调,7个蛋白表达明显差异（ratio〉5）。进一步研究发现梗死区心肌组织bFGF表达明显升高。结论：心肌梗死后蛋白表达变化趋势的探讨为心室重塑机制研究提供线索。     

低氧诱导因子-1α在低氧促成肌细胞增殖中的作用

目的:探讨低氧对大鼠骨骼肌成肌细胞(SkMs)增殖的影响及低氧诱导因子(HIF-1α)在低氧促成肌细胞增殖中的相关机制。方法:采用流式细胞仪观察了3、10%O2对SkMs细胞数量和增殖指数的影响;用RT-PCR方法检测了HIF-1αmRNA的表达,用Western blot方法检测了SkMs胞浆、胞核及总HIF-1α蛋白的水平。结果:低氧组较常氧组细胞数量和增殖指数增加(P0.05);HIF-1αmRNA、总蛋白水平在常氧组和低氧组中没有明显差异,常氧下胞浆中HIF-1α蛋白水平高于胞核内,低氧下HIF-1α蛋白水平在胞核内高于胞浆。结论:低氧能够促进SkMs增殖,HIF-1α可能是通过氧浓度调控的核转位的方式参与了低氧促SkMs的增殖。     

血必净注射液对缺氧／复氧大鼠心肌TLR4-NF-KB-IL-1β通路的影响

目的：探讨血必净注射液（XBJI）对缺氧／复氧大鼠心肌TLR4-NF-KB-IL-1β通路的抑制作用。方法：健康雄性sD大鼠36只,体重（280±30）g,随机分为6组（n=6）：正常组（N组）、平衡灌注组（BP组）、模型组（M组）、小剂量xBⅡ组（xBJII组）、中剂量XBJI组（XBJIM组）、大剂量XBJI组（XBJIH组）。通过langendorff离体心脏灌流装置,建立缺氧／复氧大鼠心肌炎性反应模型。用ELISA方法检测心肌组织中白介素113（IL-1β）的浓度;Westernblot检测心肌组织中核因子一xt3p65（NF-xB065）蛋白、T0Ⅱ样受体4（1184）蛋白的表达;RT-PCR检测心肌组织中NF-td3p65mR—NA及TLR4mRNA的表达;光镜观察其心肌光学显微结构的改变。结果：与M组比较,XBJII．组、XBJIM组、XBJIn组心肌IL-113的浓度、NF-KB-065及TLR4蛋白、NF_出p65及TLR4mRNA表达量有不同程度的下降,均以XBJIM组下降最为明显（P〈0．05,P〈0．01）;M组心肌结构损伤严重,XBJI处理后上述变化均得到改善,以XBJIM最为明显。结论：不同剂量XBJI可通过抑制TLR4-NF-KB-IL-1β信号转导通路减轻缺氧／复氧大鼠心肌的炎性反应,以4ml／100rnl的XBJI疗效最佳。