生物技术在薯蓣皂苷及其苷元生物合成中的应用

薯蓣皂苷及其苷元来源于药用植物盾叶薯蓣块茎,是合成甾体激素类药物的重要原料.由于野生盾叶薯蓣资源日渐枯竭及薯蓣皂苷及其苷元制备生产中的严重污染等问题,使其开发和生产面临严重的挑战.本文探讨了薯蓣皂苷及其苷元生产研究进展及存在的问题,概述了薯蓣皂苷及其苷元的代谢途径研究进展,展望了生物技术在薯蓣皂苷及其苷元生物合成中的应用前景.     

从盾叶薯蓣组培苗中高压酸解制备薯蓣皂苷元

采用正交试验法对盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)组培苗中薯蓣皂苷元的高压酸解制备工艺进行了研究。以薯蓣皂苷元的含量作为评价指标,选用正交表L16(45),以样品用量、硫酸浓度、提取时间为因素,设计了3因素4水平的正交试验。结果表明:高压酸解提取薯蓣皂苷元的最佳工艺条件为:样品用量25 mg、硫酸浓度0.5 mol/L、提取时间2 h,在此条件下提取物中薯蓣皂苷元的平均含量为9.12 mg/g。     

盾叶薯蓣内生真菌及其对宿主培养物生长和皂苷元生产的影响

从盾叶薯蓣根状茎中分离并鉴定了9株内生真菌,经悬浮培养14d,分别制备灭活菌丝和菌液浓缩物。其中,内生尖孢镰刀菌Dzf17能有效地提高盾叶薯蓣无菌苗和培养细胞薯蓣皂苷元的含量和产率,且灭活菌丝的诱导效果要强于菌液浓缩物。Dzf17灭活菌丝处理无菌苗,薯蓣皂苷元的产率为78.697mg/L,是对照(27.471mg/L)的2.865倍;用Dzf17菌液浓缩物处理无菌苗,皂苷元产率为41.822mg/L,是对照的1.522倍。Dzf17灭活菌丝处理培养细胞,薯蓣皂苷元的产率为1.391mg/L,是对照(0.691mg/L)的2.013倍;用Dzf17菌液浓缩物处理培养细胞,皂苷元产率为1.214mg/L,是对照的1.757倍。结果表明,在盾叶薯蓣无菌苗或细胞培养中添加一定量的内生真菌灭活菌丝或菌液浓缩物对于提高薯蓣皂苷元含量和产量将是一种有效的方法。     

盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成

研究了盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长、薯蓣皂苷元合成、蔗糖和磷酸盐的吸收利用以及酸性磷酸酶活性与薯蓣皂苷元合成的关系。结果表明,对数生长期细胞最大比生长速率μm为0.19 d-1;倍增时间为3.68 d;薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长相关,培养6 d时薯蓣皂苷元质量分数和产量分别为0.20%和25.93 mg/L;蔗糖利用率达到95.65%,磷酸盐吸收率达到最大,为90.36%。盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活性动态变化规律与薯蓣皂苷元的动态合成规律基本一致。此外,研究还发现在相同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力呈正相关;而在不同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力没有相关性。     

内生镰刀菌Dzf17多糖对盾叶薯蓣培养物薯蓣皂苷元积累的促进作用(英文)

从盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)内生镰刀菌(Fusarium oxysporum)Dzf17制备出胞外多糖(EPS)、菌丝水提多糖(WPS)和菌丝碱提多糖(SPS),研究了这3种多糖对盾叶薯蓣幼苗和细胞培养物薯蓣皂苷元积累的影响。3种多糖中,菌丝水提多糖对盾叶薯蓣幼苗和细胞培养物薯蓣皂苷元的积累有最明显的促进作用。向培养基中添加20 mg/L的菌丝水提多糖培养盾叶薯蓣幼苗和细胞,薯蓣皂苷元的产率分别为10.04 mg/L和2.40mg/L,是对照的3.11倍和3.87倍。结果表明,可以利用内生镰刀菌Dzf17多糖有效提高盾叶薯蓣培养物中薯蓣皂苷元的产量。     

盾叶薯蓣总皂苷超声提取及动力学

考察了乙醇体积分数、溶剂用量、超声时间、超声功率和超声频率对盾叶薯蓣总皂苷提取率的影响,研究了以体积分数70%乙醇溶液或水作溶剂从盾叶薯蓣中超声提取总皂苷的动力学模型。结果表明,在扩散过程中超声提取薯蓣总皂苷的动力学模型满足非定常扩散方程,相关系数为r=0.95,最佳超声时间为40min。     

不同居群盾叶薯蓣生长、叶形态及皂苷元含量的研究

对引自湖北武当山、湖南南部和西北部的12个居群盾叶薯蓣的生长状况及叶形、叶色、叶长、叶宽、叶基、叶张角等12个形态指标进行了观测和比较分析,并测定了各居群的叶和块茎中的皂苷元含量。结果表明：1）在置信水平λ=8.0340时,11个居群可划分成2大类型：①长叶型：主要形态特征为叶片长度大于宽度,中裂片相对较长;②宽叶型：主要形态特征为叶片宽度大于长度,中裂片相对较短;2）不同居群盾叶薯蓣花序数、叶片总数、开花时间、花期长短、茎干重、叶干重等存在显著的差异;3）不同居群皂苷元含量差异也较显著,居群块茎中薯蓣皂苷元含量最高达3.98%（3号）、最低（7号）仅0.33%,而居群叶中约莫皂苷元含量最高达4.27%(4号）、最低（2号）为0.98%。     

中国薯蓣属植物中的甾体皂苷及甾体皂苷元

中国薯蓣属(Dioscorea L.)植物含有约21种甾体皂苷元,其中大部分种类含有3β-羟基皂苷元,少数种类含有3α-羟基皂苷元。从薯蓣属13种植物中共分离出59个甾体皂苷成分,按化学结构可将这些甾体皂苷分为4种类型。约有17种薯蓣属植物含有甾体皂苷元(主要为薯蓣皂苷元),均为根茎组(Sect.Stenophora)种类。在查阅大量资料的基础上,对各种类所含的甾体皂苷元和甾体皂苷成分及各成分的化学结构进行了归纳和综述。     

内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的研究

目的探讨内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵宿主植物盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的能力。方法接种内生B.svelezensis HBB5及B.subtilis ATCC 6633菌株(0.35×10~8 CFU/mL)至含盾叶薯蓣地下茎组织的液体培养基,32℃、165~185 r/min连续发酵108 h,检测发酵液细菌、pH、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、淀粉酶(α-amylase)及薯蓣皂苷元溶出率等指标。结果内生B.svelezensis HBB5菌株有较强的酸、碱耐受力[pH(4.8±0.2)~(8.4±0.2)],相比B.subtilis ATCC 6633[pH(5.2±0.2)~(8.7±0.2)]差异不明显;前者达峰值生长量(60×10~(8±2) CFU/mL)明显高于后者(32×10~(8±2) CFU/mL)。发酵36~60 h时,B.svelezensis HBB5、B.subtilis ATCC 6633菌株发酵液的淀粉、麦芽糖、葡萄糖浓度达峰值,分别为(37.41±3.12)、(27.83±2.14)ng/mL,(21.06±1.25)、(16.54±1.08)ng/mL,(54.33±3.12)、(36.65±2.10)ng/mL,前者均高于后者。同时,B.svelezensis HBB5菌株维持高的α-amylase酶活性及薯蓣皂苷元溶出率。结论内生B.svelezensis HBB5菌株拥有较强的耐酸碱、降解淀粉、提高薯蓣皂苷元溶出的能力,为工业生产薯蓣皂苷元提供了一个新的方法。     

穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元含量的动态分析

目的：对穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元的含量进行动态分析。方法：超临界CO2萃取技术提取,高效液相色谱法测定含量。结果：穿龙薯蓣根茎中花期薯蓣皂苷元含量最高为1．35％,枯萎期含量最低为1．03％。穿龙薯蓣地上部分不同生长时期均不合薯蓣皂苷元。结论：穿龙薯蓣根茎中花期薯蓣皂苷元含量最高,枯萎期含量最低。穿龙薯蓣地上部分不同生长时期均不合薯蓣皂苷元。     

黄姜中薯蓣皂甙元的提取及定性定量分析

对黄姜中提取的薯蓣皂甙元进行红外和紫外可见波谱扫描,与标准品谱图对比分析,可知提取出的皂甙元与薯蓣皂甙元标准品有相同的结构。用分光光度法测定黄姜中薯蓣皂甙元的含量,以香荚兰醛-高氯酸-冰醋酸的加入顺序,在80℃水浴中加热15min,显色30min后,在542nm处测定吸收值能达到最佳值,最后得出皂甙元含量为2.27%,RSD为1.1%,回收率在97.2%~98.8%之间。     

湖北薯蓣属植物资源

湖北薯蓣属植物有１４种,３变种,１亚种,属于块茎组的有７种,２变种,均含多量淀粉,不含薯蓣皂甙元。属于根状茎组的有７种,１变种,１亚种,除含淀粉外,都含有一定量的薯蓣皂甙元,其中盾叶薯蓣的含量最高,平均含量为３％,且其含量随生长环境而变化,由南向北呈递增趋势,盾叶薯蓣在湖北主要分布在宜昌地区,襄樊,神农架和郧阳地区,蕴藏量约３．５万吨。     

镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响

研究了镰刀菌(Fusarium solani)诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响。结果表明:当培养基中诱导子糖含量达到30 mg GE/L时能使薯蓣皂素的含量明显提高;薯蓣皂素含量的最大值出现在镰刀菌诱导子处理后的第35 d,达到对照的2倍左右;盾叶薯蓣离体培养物PPO、SOD活性以及可溶性蛋白含量在添加诱导子后呈现一定的规律性变化。     

激素对盾叶薯蓣愈伤组织细胞生长和薯蓣皂甙元合成的调控

不同生长素对盾叶薯蓣 (DioscoreazingiberensisC .H .Wright)愈伤组织细胞生长量的影响差异是NAA >IAA >2 ,4 D ,而对薯蓣皂甙元合成的影响是 2 ,4 D >IAA >NAA。在有生长素存在的条件下 ,光照 2 4h ,另加 0 5mg LKT促进愈伤组织细胞的生长 ,而附加 0 5mg LBA促进薯蓣皂甙元的合成 ;相反 ,光照 12h ,另加 0 5mg LBA促进生长 ,附加 0 5mg LKT促进合成。愈伤组织生长越旺 ,薯蓣皂甙元积累越少。低浓度的生长素促进薯蓣皂甙元的合成。     

盾叶薯蓣环阿屯醇合酶全长基因的克隆与分析

环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)是薯蓣皂甙元生物合成途径中的第一个关键酶.以基因组DNA为模板,利用染色体步行和长距离PCR方法首次克隆了盾叶薯蓣CAS全长基因.序列分析比较结果表明,盾叶薯蓣CAS全长基因为7 192 bp,由18个外显子和17个内含子组成.外显子总长为2 280 bp,编码759个氨基酸,最长的外显子为198 bp,最短的为47 bp;内含子总长4 912 bp,最长的内含子为1 551 bp,最短的为68 bp.Southern blot杂交分析表明,CAS基因在盾叶薯蓣基因组中为单拷贝.     

Isolation and Indentification of Steroidal Saponins from Dioscorea zingiberensis Wright

Four known steroidal compounds were isolated from the rhizomes of Dioscorea zingiberensis Wright gathered from Hubei Province. Their structures were identified by means of spectroscopic analyses as Epi-smilagenin[Ⅰ]; 3-O-(β-D glucopyranosyl) diosgenin[Ⅱ]; 3-O-[β-D-glucopyranosyl (1→ 4)-β-D-glucopyranosyl-diosgenin[Ⅲ]; 3-O {β-D glucopyranosyl (1→ 3)-[α-L-rhamnopyranosyl (1 →2)]-β-D glucopyranosyl} diosgenin [Ⅳ].     

The Quantitative Analysis and Identification of Steroidal Sapogenins of the Dioscorea Plant

The results for the quantitative analysis and identification of steroidal sapo-genins of 16 species of Dioscorea rhizomes are given in Table 1. The amount of steroidal sapogenin varies from 0.073%–5.93%, its highest content of diosgenin is 5.93% in D. zingiberensis C. H. Wright. 2. The results observed from paper chromatography, thin layer chromatography and gas-liquid chromatography revealed that except the sapogenin of D. chingii Pr. and Br. is similar to tokorogenin, all other sapogenins after recrystallization yield a spot identical to diosgenin or yamogenin. Meanwhile, in most Dioscorea sample, a spot identical to △ 3, 5-diene-25D-spirostane was shown by using thin layer chromatography and gas-liquid chromatography. (Table 2). 3. The results observed from infrared spectrum and gas-liquid chromatography revealed that the sapogenins of D. collettii, Hook. f; D. collettii. Hook, f. var. hypoglauca, Pei and Ting. and D. tokoro Makino. contained 25L-spirostane. (A900≤ A920 cm-1).