褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基全长cDNA序列的克隆及分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基(NQO)基因的全长cDNA片段,并进行了核苷酸序列测定.结果表明,该cDNA片段长度为1930 bp,所编码的蛋白与家牛、小家鼠、食蟹猴、人和蟾蜍的NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基的氨基酸序列的同源性分别达到77%、76%、76%、75%和75%.Southern杂交分析表明,NQO基因在褐飞虱基因纽中以单拷贝形式存在.     

两个具多倍体减数分裂稳定性的多倍体水稻品系的选育

多倍体化是植物进化的主要途径之一, 主要的粮棉油作物大都是多倍体, 它们在倍性增加的同时, 带来产量成倍增长. 在自然进化启示下, “利用远缘杂交和多倍体双重优势选育超级稻”是一个新途径. 但结实率低是一个制约多倍体水稻育种发展的瓶颈问题. 根据蔡得田等人提出的育种战略, 把研究重点放在类Ph基因材料选育上. 通过几年的籼粳杂交和回交选择与检测, 选育出2个具有多倍体减数分裂稳定性(polyploid meiosis stability, PMeS)的多倍体水稻品系PMeS-1, PMeS-2. 其选育过程包括亲本选择、杂交或复合杂交、连续回交、染色体加倍、多倍体鉴定、结实性选择、自交稳定成品系等7个步骤. 多倍体减数分裂稳定性的特性则通过减数分裂行为观察和高结实性杂交测定来确定. PMeS-1和PMeS-2都为粳型品系. 它们具有3个显著特点: 一是自身结实率较高, 超过65%; 二是与许多籼稻、粳稻多倍体品种杂交产生结实率高(>70%)、优势强的杂交后代; 三是表现出减数分裂稳定性, 即花粉母细胞减数分裂前期主要以二价体和四价体配对, 极少出现高价体、单价体和三价体, 中期很少出现落后染色体, 后期和末期未见微核. 而对照品系Dure-4X花粉母细胞减数分裂表现异常, 前期较高频率出现高价体、单价体和三价 体, 中期高频率出现落后染色体, 后期和末期有微核出现. 本研究建立了一种多倍体水稻选育的基本体系, PMeS品系选育方法与一般二倍体品系比较有三点不同, 即染色体加倍、多倍体检测 和高结实性检验. 利用PMeS品系基本上解决了多倍体水稻结实率低这个长期困扰多倍体水稻育种的难题, 为广大育种学家利用这种基因材料选育多倍体水稻新品种提供了良好的条件.     

褐飞虱细胞色素P450基因CYP4C62的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】细胞色素P450单加氧酶在昆虫生长发育和适应环境过程中发挥着重要功能。【方法】本研究克隆了褐飞虱Nilaparvata lugens细胞色素P450基因CYP4C62的开放阅读框（不含信号肽编码序列部分）,在大肠杆菌Escherichia coli中实现了高效表达,经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了重组的CYP4C62蛋白。将该蛋白免疫日本大耳白兔Oryctolagus cuniculus雄兔,制备了兔抗CYP4C62血清抗体。采用间接ELISA方法检测了血清抗体的效价;并通过Western印迹杂交检测了该抗体的免疫学特异性。【结果】结果表明,通过大肠杆菌表达出的CYP4C62蛋白相对分子量为56 kD。间接ELISA法检测表明,制备的兔抗CYP4C62抗体的效价达到1∶100 000。Western印迹杂交证实,该抗体既可与异源表达的CYP4C62蛋白特异性结合,也可以与褐飞虱总蛋白中内源的CYP4C62特异性结合,表明具有较好的免疫反应特异性。【结论】CYP4C62多克隆抗体的成功制备,为后续分析CYP4C62在褐飞虱各组织中的时空表达水平,并通过免疫组织化学法定位分析该蛋白的组织、细胞及亚细胞分布规律,及最终解析CYP4C62的生物学功能奠定了基础。     

药用野生稻应答稻飞虱取食过程中基因表达的研究

褐飞虱和白背飞虱是水稻的刺吸式害虫。为了探讨水稻对虫害反应的分子机理,采用cDNA—AFLP(互补DNA扩增片段长度多态性)技术,研究了药用野生稻受这两种飞虱取食后基因表达的变化。通过调查约7％的虫．崮答后的药用野生稻转录本组,共分离了258个差异片段,测序112个;44个片段对应于已知或假定功能基因,其中35个基因的表达水平在白背飞虱为害后发生改变,24个基因在褐飞虱为害后改变。下调的基因比上调的基因多。有14个基因受这两种飞虱共同调节(2个上调,12个下调)。结果表明,药用野生稻对两种飞虱为害作出的反应有所不同。     

甘蓝型油菜线粒体功能未知基因 ORF 117的载体构建与转化

本研究克隆了甘蓝型油菜线粒体功能未知基因 ORF 117,构建了带有线粒体转运信号肽序列（TP ）的植物过表达载体35S ∷TP-ORF117、35S ∷TP-EGFP 和35S ∷TP-ORF117-EGFP ,转化野生型拟南芥并进行抗除草剂筛选,共获得纯合的转基因拟南芥株系62个。qPCR 表明,ORF 117在转基因材料中得到高效过表达。用转35S ∷TP-EGFP 、35S ∷TP-ORF117-EGFP 拟南芥制备原生质体,经线粒体特异染料染色,在激光共聚焦显微镜下做线粒体、GFP 共定位检测,GFP 蛋白和 ORF117-EGFP 融合蛋白被准确定位到了线粒体。     

能量代谢工程促地衣芽胞杆菌DW2高效合成杆菌肽

杆菌肽是一种主要由芽胞杆菌产生的广谱性环肽类抗生素,目前广泛应用于兽药领域。能量代谢在微生物高效合成目的代谢产物中具有重要作用。文中以杆菌肽工业生产菌株地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis DW2为出发菌株,首先构建了呼吸链分支途径细胞色素bd泛醇氧化酶基因cydB缺失菌株,发现cydB缺失后杆菌肽效价和胞内ATP浓度相比于对照菌株分别提高了10.97%和22.96%。接着,证实了强化表达另外一条呼吸链分支途径——细胞色素aa3氧化酶基因qoxA能够提高杆菌肽合成水平,其杆菌肽效价和胞内ATP浓度相比于对照菌株分别提高了18.27%和34.00%。强化ADP合成供给也是促进胞内ATP积累的有效策略,结果表明强化表达腺苷激酶DcK和腺苷酸激酶AdK均可以提高杆菌肽效价和胞内ATP浓度,其中强化表达DcK效果较好,其杆菌肽效价相比对照提高16.78%。最后,通过组合代谢工程育种,在基因cydB缺失菌DW2ΔcydB基础上整合表达了qoxA和dck,得到工程菌株DW2-CQD(DW2ΔcydB::qoxA::dck),发酵结果表明,DW2-CQD杆菌肽效价达到954.25 U/mL,相比于对照菌株提高了21.66%,单位菌体杆菌肽效价为2.11 U/CFU,相比对照提高了11.05%。此外,DW2-CQD胞内ATP浓度为39.54 nmol/L,相比于对照提高了49.32%。结果证实能量代谢工程是提高杆菌肽发酵水平的有效策略,提供了一株具有工业化应用前景的杆菌肽生产菌株。     

AChE在水稻抗性诱导的褐飞虱凋亡中肠细胞中的定位及表达

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens是水稻的重要害虫之一。本研究旨在了解水稻品种抗性诱导的褐飞虱中肠细胞凋亡与细胞中乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACh E)的关系。【方法】从4龄Ⅰ型褐飞虱若虫中肠组织分离原代细胞,用不同抗性的水稻幼苗汁液处理第一代继代细胞,利用TUNEL染色法检测细胞的凋亡情况,再分别利用免疫组织化学和荧光定量PCR技术对ACh E进行亚细胞定位和检测其表达水平的变化。【结果】在对照组(未处理)细胞中,检测不到代表凋亡细胞核的绿色荧光,而免疫组化后阳性反应颜色很浅,表明细胞中存在ACh E的本底水平表达。感虫水稻品种TN1幼苗汁液处理细胞中,细胞的凋亡率为8%,抗性水稻B5幼苗汁液处理的细胞中有65%的细胞发生凋亡;而抗性水稻TKM-6幼苗汁液处理的细胞中则有85%的细胞发生凋亡。免疫组化的检测结果表明,所有凋亡的细胞中都存在ACh E的积累,且主要分布在细胞质中;ACh E在凋亡后期并不迁入凋亡小体中,而是集中在细胞核附近。荧光定量PCR检测表明,TKM-6,B5和TN1幼苗汁液处理的细胞中ACh E的表达量分别为对照细胞的29.9,18.4和8倍,该结果与细胞水平上免疫组化的检测结果一致。【结论】本研究结果证实了水稻品种抗性与其诱导的中肠细胞凋亡率呈正相关,且凋亡细胞的细胞质中存在ACh E的积累。这些发现为揭示ACh E在褐飞虱与水稻的互作中的功能、促进抗性水稻新品种的选育及开发新的褐飞虱防治措施提供了一定的参考信息。     

一株絮凝菌的鉴定、絮凝基因定位及其絮凝剂成分分析

从武汉市综合废水处理的活性污泥中筛选得到一株絮凝剂产生菌株MBF03,其絮凝率达到90％以上,絮凝效果稳定.通过16S rDNA鉴定,该菌为泛菌属,扫描电镜结果显示为杆状.通过质粒转化与质粒消除试验,初步证实了MBF03菌的絮凝基因位于染色体上.提取该菌所产的絮凝剂,进行紫外、红外分析,结果表明,该絮凝剂主要成分是胞外多糖类物质,不含蛋白质和核酸.     

盾叶薯蓣环阿屯醇合酶全长基因的克隆与分析

环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)是薯蓣皂甙元生物合成途径中的第一个关键酶.以基因组DNA为模板,利用染色体步行和长距离PCR方法首次克隆了盾叶薯蓣CAS全长基因.序列分析比较结果表明,盾叶薯蓣CAS全长基因为7 192 bp,由18个外显子和17个内含子组成.外显子总长为2 280 bp,编码759个氨基酸,最长的外显子为198 bp,最短的为47 bp;内含子总长4 912 bp,最长的内含子为1 551 bp,最短的为68 bp.Southern blot杂交分析表明,CAS基因在盾叶薯蓣基因组中为单拷贝.     

褐飞虱细胞色素P450单加氧酶基因CYP4CE1的克隆及表达谱

为了解P450基因在褐飞虱Nilaparvata lugens适应水稻品种过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）,快速扩增cDNA末端（RACE）和长距离聚合酶链式反应（LD-PCR）技术,克隆了褐飞虱4龄若虫的CYP4家族的一个P450单加氧酶基因,被命名为CYP4CE1。该基因的全长cDNA序列（2 160 bp）含有一个1 626 bp的开放阅读框（ORF）,编码541个氨基酸残基的蛋白质。通过GenBank数据库中的blastx搜索引擎进行同源性分析,结果表明CYP4CE1编码的蛋白与岸蟹 Carcinus maenas的CYP4C39（GenBank登录号：JC8026）的相似性最高,两者的氨基酸序列同源性达43％;其次与热带蟑螂 Blaberus discoidalis的CYP4C1（AAA27819）及黑腹果蝇Drosophila melanogaster的CYP4C3（NP_524598）的相似性也较高,氨基酸序列同源性分别达42％。氨基酸序列比对表明该蛋白含有CYP4家族成员的所有保守特征序列,如螺旋K（E--R--P）,氧结合结构域即螺旋I（AG--T）,血红素结合区（PF--G---C-G--F）以及CYP4成员的特有特征序列（EVDTFMFEGHDTT）等。使用Northern杂交检测CYP4CE1随时间的表达变化,结果表明：与饲养于感虫水稻台中1号（Taichung Native 1,TN1）上的若虫相比,在取食中度抗性水稻Minghui 63（MH63）秧苗12,24,48,72 h的各时间段的褐飞虱体内,该基因有2.1倍的过量表达且表达水平保持稳定。进一步通过Northern杂交检测该基因的组织表达特异性,结果显示：该基因在取食TN1秧苗的若虫脂肪体中表达量最高,在肠道组织及体壁中的表达水平较低;褐飞虱取食MH63秧苗24 h后,该基因在体壁及脂肪体中的表达量略有上升（各约1.2倍）,而在肠道组织中的表达量则大幅升高（约12倍）。肠道整体原位杂交表明,CYP4CE1在取食TN1秧苗的若虫的肠道组织及马氏管中均有本底水平的表达;若虫取食MH63秧苗后,该基因在上述肠道各区段表达水平明显增强。结果提示,在褐飞虱与水稻互作过程中CYP4CE1的重要功能之一可能是参与水稻有毒次生物质的代谢。