山东省玉米矮花叶病毒的生物学特性及基因组全序列测定

对山东省玉米矮花叶病毒原分离物(SD)进行了寄主范围、血清学等普通生物学鉴定,测定了该病毒的基因组核苷酸全序列。该病毒基因组RNA由9596个核苷酸组成(不包括3’—polyA的长度),整个基因组按一个ORF编码一个3063个氨基酸的多聚蛋白。序列比较表明,该病毒分离物(SD)与玉米矮花叶病河南分离物(HN,EMBL登录号：AF94510)核苷酸全序列同源性最高,为98．2％,与已报道的甘蔗花叶病毒(SCMV)7个分离物同源性也高达79．5％-98．2％,但与玉米矮花叶病毒保加利亚分离物(MDMV—B8,AJ001691)和高梁花叶病毒萧山甘蔗分离物(SrMV—XoS,AJ310197)的同源性仅为67．8％和69．3％,与约翰逊草花叶病毒(226920,JGMV)差异最大。系统进化树分析也表明,该病毒与SCMV分离物位于同一进化簇,而与MDMV进化关系很远。     

由高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒引发的浙江甘蔗花叶病害

从浙江省5个地区采集表现花叶症状的甘蔗病叶,用马铃薯Y病毒科简并引物做PCR扩增及测序鉴定.序列分析表明,5个甘蔗样品均含有高粱花叶病毒(SrMV),其中3个样品中还存在甘蔗花叶病毒(SCMV)的复合侵染.序列比较和系统进化树分析表明,浙江甘蔗样品中的SrMV序列彼此很相似,核苷酸同源性大于93%,与已报道的4个美国分离物在CP区域同源性很高,但是3′非编码区的同源性却仅为70%左右.SCMV欧洲和中国玉米分离物及美国、南非和澳大利亚甘蔗分离物分别形成两个远缘群体,浙江甘蔗分离物群体位于两者之间;群体间CP氨基酸序列同源性均大于80%.甘蔗和玉米上的SCMV差异明显,多为无义突变.     

杭州地区发生的玉米花叶病由甘蔗花叶病毒引起

从杭州地区呈现玉米矮花叶典型症状的玉米病组织中提纯得到大量线状病毒粒子,大多数长度为750?nm。病组织中含有大量风轮状内含体和板状集结体。病毒外壳蛋白为33.6 kD。病毒RNA13’端序列(1.8 kb)与甘蔗花叶病毒(SCMV)同源性最高,达71.5%～99.1%,与高梁花叶病毒(SrMV)同源性次之,为67.8%～68.5%,与玉米矮花叶病毒(MDMV)同源性最低,仅为38.4%～48.4%,从而初步认为此病害由SCMV引起。根据已发表的SCMV外壳蛋白氨基酸序列作亲缘性分析,表明SCMV可分为美国、南非、澳大利亚;德国和中国三大类。     

杭州地区发生的玉米花叶病由甘蔗花叶病毒引起

从杭州地区呈现玉米矮花叶典型症状的玉米病组织中提纯得到大量线状病毒粒子,大多数长度为750nm。病组织中含有大量风轮状内含体和板状集结体,病毒外壳蛋白为33.6kD。病毒RNA1 3'端序列（1.8kb）与甘蔗茶花经叶病毒（SCMV）同源性最高,达71.5%-99.1%,与高梁花叶病毒（SrMV）同源性次之,为67.8%-68.5%,与玉米矮花叶病毒（MDMV）同泊性最低,仅为38.4%-48.4%,从而初步认为此病害由SCMV引起。根据已发表的SCMV外壳蛋白氨基酸序列作亲缘性分析,表明SCMV可分为美国、南非、澳大利亚、德国和中国三大类。     

甘蔗花叶病毒3’末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV-CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaI位点上,筛选得到多个重组质粒。选取其中一个克隆SCMV-CA54进行测序,得到一个全长为1296 bp的核苷酸序列。这段序列由一个长为1044 bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279 bp的3’末端非编码区序列（3'-UTR）及poly(A)尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白b（NIb）基因序列。将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离物CP核苷酸序列的同源性介于63.7%～77.6%之间,氨基酸的同源性介于64%～89%之间。根据马铃薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV-CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系划分标准之间。这是我国首次报道SCMVCP基因序列。     

甘蔗花叶病毒3‘末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV－CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaⅠ位点上,筛选得到多个重组质粒,选取其中一个克隆SCMV－CA54进行测序,得到一个全长为1296bp的苷酸序列,这段序列由一个长为1044bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279bp的3‘末端非编码区序列（3‘-UTR)及poly（A）尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白（b(NIb）基因序列,将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离的CP核苷酸序列的同源性介于63.7％－77.6％之间,氨基酸的同源性介于64％－89％之间。根据马玲薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV－CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系进分标准之间,这是我国首次报道SCMV CP基因序列。     

大豆花叶病毒黄淮5号株系的基因组全序列分析

测定了大豆花叶病毒(SMV)我国黄淮5号(Y5)株系的基因组全序列.该病毒基因组全长9*!585个核苷酸,3′-末端具poly(A)尾,包含单一开放读码框,编码一个349.2kD的多聚蛋白.基因组全序列和美国SMV G2和G7株系的核苷酸同源性分别为97.4%和96.9%.多聚蛋白酶解后产生马铃薯Y病毒属典型的10个成熟蛋白.Y5、G2和G7 3个株系的不同成熟蛋白间氨基酸序列的同源性为89.6%～100%.多重比较分析表明,Y5株系P1蛋白N-末端区域与G2和G7存在明显差异.进一步分析显示,这3个株系的6K1、6K2、NIa-Pro、NIa-VPg、NIb蛋白中心区域和CP蛋白高度保守,P1蛋白N-末端,CI和P3蛋白C-末端以及HC-Pro蛋白变异较大,但是美国G2和G7株系已报道序列P1蛋白区域存在可能的测序错误.     

大麦黄矮病毒GAV基因组全序列测定及其结构分析

测定了在中国分离得到由麦二叉蚜和麦长管蚜传播的大麦黄矮病毒GAV的基因组核苷酸全序列, 该病毒分离物的RNA由5685个核苷酸组成, 内含6个开放阅读框架(ORF)和4个非编码区(UTR), 基因组大小和结构与黄症病毒属(Luteovirus)的大麦黄矮病毒PAV(BYDV-PAV)和MAV(BYDV-MAV)相似. 序列分析表明, 它与BYDV-MAV的PS1分离物基因组序列的同源性最高. 在6个开放阅读框架中, 除ORF6核苷酸序列同源性为72.0%外, 其他ORF的核苷酸序列同源性均大于90%. 两者全基因组的同源性为90.4%. 推导的编码产物氨基酸序列同源性除P6和通读蛋白(RTP)分别为67.4%和87.4%外, 其他均大于90%, 其中外壳蛋白(CP)为95.5%. 根据与BYDV-MAV的相似性, BYDV-GAV应是一种与BYDV-MAV类似的病毒.     

莴苣花叶病毒浙江余杭分离物基因组全序列及其结构分析

测定了莴苣花叶病毒(LMV)浙江余杭分离物基因组全序列.此病毒分离物基因组由10*!080个核苷酸组成,具典型的马铃薯Y病毒科成员基因组结构,与已报道的欧洲、美国和巴西LMV核苷酸同源性为96.7%～98.8%,氨基酸同源性97.8%～99.0%.根据外壳蛋白氨基酸序列和5′端非编码区核苷酸序列分析比较及分子进化树分析,可将全球LMV分为西欧-加利福尼亚、希腊和也门3个类群.LMV有可能起源于加利福尼亚州向西欧,进而向希腊和也门扩展,浙江余杭LMV有可能来源于加利福尼亚州和西欧.     

豇豆病毒病病原的分子鉴定

为澄清浙江省豇豆病毒病病原及其分类,采用马铃薯Y病毒属通用引物Sprimer扩增了浙江豇豆线状病毒基因组3′－末端序列。同时又根据已知CMV RNA3序列设计引物pCMV-44-63/1200-1181,扩增了混合的CMV－ZJ运动蛋白基因全序列。外壳蛋白氨基酸序列分析表明,产中仅存在一种线状病毒（CV－ZJ）,该病毒与一泰国豇豆蚜传花叶病毒（CABMV）具有最高的同源性（98.6%）,与花生条纹病毒（PStV）、石斛花叶病毒（DeMV0．）、赤豆花叶病毒（AZMV）、黑眼豆豆花叶病毒（BICMV）和菜豆普通花叶病毒（BCMV）分离物间的同源性为88.5%－94.4%,而与其它CABMV分离物的同源性均低于70％。进化树分析表明,PStV、AZMV、DeMV、BlCMV和BCMV为同种异名,应统称为BCMV,而CABMV为另一种病毒;CV－ZJ和泰国CABMV分离物应分类为BCMV豇豆株系。CMV－ZJ的运动蛋白序列分析表明,该分离物属于CMV亚组Ⅰ,与其它分离物氨基酸序列同源性为93.1%－97.8%。     

小麦黄花叶病毒基因组核苷酸序列分析

以小麦黄花叶病毒 (WYMV)HC分离物为材料 ,合成病毒基因组cDNA并进行序列分析 .结果表明 ,病毒RNA1共有 76 2 9个核苷酸 ,编码 1种由 2 40 7个氨基酸组成的多聚蛋白 ,切割产生病毒外壳和其他 7种可能的蛋白质 .该病毒的RNA2共有 36 39个核苷酸 ,编码 1种由 90 3个氨基酸组成的蛋白 ,可能切割产生 2种非结构蛋白 .WYMV虽然与小麦梭条花叶病毒 (WSSMV)在基因组结构上具有相似性 ,但是两者间在核苷酸及氨基酸水平上的同源性却分别低于 70 %和 75 % .由此结果可以确认 ,WYMV与WSSMV是大麦黄花叶病毒属 (Bymovirus)的 2种不同病毒 .     

小麦黄花叶病毒基因组核苷酸序列分析*1)

以小麦黄花叶病毒(WYMV)HC分离物为材料,合成病毒基因组cDNA并进行序列分析.结果表明,病毒RNA1共有7 629个核苷酸,编码1种由2 407个氨基酸组成的多聚蛋白,切割产生病毒外壳和其他7种可能的蛋白质.该病毒的RNA2共有3 639个核苷酸,编码1种由903个氨基酸组成的蛋白,可能切割产生2种非结构蛋白.WYMV虽然与小麦梭条花叶病毒(WSSMV)在基因组结构上具有相似性,但是两者间在核苷酸及氨基酸水平上的同源性却分别低于70%和75%.由此结果可以确认,WYMV与WSSMV是大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的2种不同病毒.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物全基因组序列测定

以感病组织总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并测定黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)辽宁分离物(CGMMV-LN)的基因组全序列。CGMMV-LN基因组全长6 422 nt,5'非编码区(noncoding region,NCR)和3'NCR分别为59 nt和175 nt。CGMMV-LN编码的4个蛋白依次是186 kD和129kD的复制酶,29 kD的移动蛋白和17.4 kD的外壳蛋白。CGMMV-LN与其他4个CGMMV分离物基因组核苷酸序列同源性为97.6%～99.3%,与同属其他3种病毒基因组核苷酸序列同源性仅为61.7%～62.8%。基于186kD复制酶和外壳蛋白氨基酸序列的同源树显示:侵染葫芦科作物的烟草花叶病毒属病毒可分为2个亚组,亚组I包括所有CGMMV分离物,亚组II包括Kyuri绿斑驳花叶病毒(Kyuri green mottle mosaic virus,KGMMV)、黄瓜果实斑驳花叶病毒(Cucumber fruit mottle mosaic virus,CFMMV)和小西葫芦绿斑驳花叶病毒(Zucchini ...     

侵染人参果的马铃薯M病毒基因组全序列分析

测定了侵染人参果的马铃薯M病毒(PVMCh)基因组全序列。线状、单链正义RNA全长8526bp,含6个开读框(ORF),具麝香石竹潜隐病毒属(Genus Carlavirus)典型结构特征。序列比较表明它与其他PVM分离物各基因核苷酸和编码蛋白氨基酸序列同源性分别为62.5%～9702%和60.9%～97.4%,其中CP基因最保守,而TGB3基因变异最大。系统进化树分析表明美国爱达荷州马铃薯分离物(PVMId) (AF023877)为PVM的一个远缘株系,而其他4个PVM分离物的成簇在外壳蛋白(Coat protein, CP)和核酸结合蛋白(Nucleic acid binding protein, NABP)区域略有差异。这是PVM在人参果上侵染的首次报道。     

辣椒脉斑驳病毒文昌分离物基因组测序及分析

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫.本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物(ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC)的基因组.分段克隆的测序结果通过拼接,共获得ChiVMV-WC基因组9 717个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号:GQ981316).在核苷酸序列的第164位~第9 270位存在一个大的开放阅读框(ORF),编码一个多聚蛋白(分子量为350.44 kD).近年来被证实的马铃薯Y病毒科的一个新的ORF (pretty interesting potyviridae ORF,PIPO)存在于ChiVMV-WC基因组核苷酸序列的第2 892位~第3 110位,编码一个由72个氨基酸聚合而成的多肽(分子量为8.26 kD).ChiVMV-WC与ChiVMV其它分离物的基因组核苷酸序列比较发现该病毒存在着较高的变异率.本研究通过与同属内病毒的同源性分析以及系统进化树分析,确定了ChiVMV-WC在生物进化史上的地位.     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4 cDNA克隆、序列分析及其编码蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒(Beet Necrotic Yellow Vein Virus,简称BNYVV)内蒙分离物(NM)RNA为模板,通过反转录和PCR扩增得到了BNYVV RNA4基因组的cDNA克隆pGBF6。序列分析结果表明,pGBF6含有全长RNA4 cDNA插入片段,大小为1465个核苷酸,含有一个849个核苷酸的开放阅读框架,编码产生由282个氨基酸组成的分子量为31kDa的蛋白。与法国F2分离物RNA4相比,其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别为97.1％和96.4％,并在5'端非编码区比F2分离物缺失了3个核苷酸。将RNA4编码区cDNA克隆到原核表达载体pFLAG·MAC上,获得融合蛋白表达质粒pFMBF87。所构建的融合蛋白由载体序列编码的14个氨基酸和31kDa蛋白C端的233个氨基酸组成。经IPTG诱导,Westem blotting分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达。本文还对内蒙分离物的株系划分进行了讨论。     

CMV甜瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及植物表达载体的构建

从河南省临颖县采集的病毒感染的甜瓜样本经ELISA检测和接种分离获得黄瓜花叶病毒(Cucunber mosaic virus ,CMV) 分离物.把该分离物接种西葫芦, 从发病的叶片中提取总RNA,并以此为模板经RT-PCR扩增获得CMV的外壳蛋白(cp)基因,将其克隆到pUCm-T质粒上.经序列测定和分析,结果表明该cp基因由657个核苷酸组成,编码218个氨基酸.其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组I的分离物有较高的同源性,达92.2%～93.9%,与亚组II的同源性仅为76.8%～77.8%,与我国报道的CMV分离物的cp基因序列比较,除香蕉株系XB外核苷酸序列的同源性达91.8%～93.4%.根据这些分析,该CMV分离物属于亚组I.将cp基因通过中间载体pJIT163定向克隆到植物表达载体pBINPLUS中(重组双元载体质粒命名为pBCP),并经冻融法导入农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.利用该植物表达载体对西瓜的遗传转化工作目前正在进行中.     

玉米矮花叶病毒研究进展

玉米矮花叶病毒 (Maizedwarfmosaicvirus,MDMV)是在世界范围内广泛分布的重要病毒 ,文中从寄主范围、传播、株系状况、分子生物学及检测等方面 ,对MDMV的国内外研究现状进行了阐述。     

侵染花生的黄瓜花叶病毒CA株核酸全序列分析

对侵染花生的黄瓜花叶病毒CA(CMV-CA)株系进行克隆和序列分析.CMV-CA RNA1全长3 356个核苷酸(nt),编码分子量为111kDa 的1a 蛋白;RNA2全长3045nt,编码分子量为96.7kDa 的2a蛋白和13.1kDa的2b蛋白;RNA3全长2219nt,编码分子量为30.5kDa的3a蛋白和分子量为24kDa的外壳蛋白(CP).序列同源性比较表明,CMV-CA RNA1、2、3与CMV亚组IA CMV-Fny、亚组IB CMV-SD、亚组II CMV-Q 株系序列同源性,RNA1分别为91.3%、91.1%和76.5%,RNA2分别为92.1%、90%和71.2%,RNA3分别为96.1%、92.6%和74.5%;与同属花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV) RNA1、2、3序列同源性分别为67.1%、58.2%和55.7%.上述研究未发现CMV-CA基因组与PSV RNA链的重组,CMV-CA对花生的侵染应是该株系适应于花生的遗传变异、长期进化的结果;对RNA3 5′NTR结构分析以及RNA3 5′NTR和 CP 系统进化树分析表明,CMV-CA属CMV IB亚组.     

蚕豆萎蔫病毒2号山西分离株的全基因组序列测定与分析

本试验在生物学接种的基础上,利用非序列依赖性PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）对感病青椒（Capsicum annuum）进行了分子鉴定. 序列测定及分析发现,侵染青椒的病毒为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2, BBWV2）. 为明确BBWV2青椒分离物（BBWV2 Ca）的分类地位,对BBWV2 Ca的全基因组序列进行了分段克隆、序列测定和分析. BBWV2-Ca RNA1全长5 929 bp,含有1个ORF. BBWV2 Ca RNA2全长3 559 bp,含有1个ORF,编码3种蛋白：VP53/VP37、外壳蛋白大亚基（large coat protein, LCP）和外壳蛋白小亚基(small coat protein, SCP). 全序列核苷酸同源性分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在77.9%～93.7%之间|RNA2与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在80.2%～93.8%之间. 全序列系统进化分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2-XJ14-3以及BBWV2-RP3株系聚为一簇,亲缘关系最近|RNA2与BBWV2-Am形成一个独立分支,亲缘关系最近.