香蕉条斑病毒ORFⅠ、ORFⅡ在大肠杆菌中的原核表达和自激活特性的鉴定

目前,香蕉条斑病毒所有3个ORF表达产物功能均不明确,通过双杂技术研究病毒未知蛋白与宿主蛋白的互作,可以初步推断未知蛋白的功能。本实验旨在构建香蕉条斑病毒ORFⅠ和ORFⅡ在细菌双杂系统中的诱饵质粒。首先以课题组保存的连接有香蕉条斑病毒河口分离物全基因组的pMD-18T载体DNA为模板,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与带有λcI基因的pBT载体共同双酶切及T4连接酶连接后,得到与λcI基因融合表达的重组载体pBT-ORF1和pBT-ORF2。转化大肠杆菌XL1-BlueMRF'报告菌株,用IPTG(0.1mmol/L)诱导目的基因片段表达。Westernblotting结果表明,ORF1-λcI和ORF1-λcI两种融合蛋白均成功表达,且大小与预期一致。之后,pBT-ORF1及pBT-ORF2分别与空质粒pTRG共转化XL1-BlueMRF'报告菌株,pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为阴性对照。结果显示pBT-ORF1及pBT-ORF2均无自激活现象,可以进行后续的细菌双杂工作。本实验为BSV与宿主的细菌双杂系统的建立及蛋白组学的研究奠定了基础。     

感染BBTV香蕉叶片cDNA文库的构建及评价

为了研究香蕉束顶病毒与香蕉寄主致病的互作分子机制,本文报道利用Make Your Own“Mate＆Plate^TM”Library System试剂盒成功构建感染BBTV香蕉叶片的cDNA文库。通过改良CTAB法提取感染BBTV香蕉叶片的总RNA,采用SMART法反转录合成双链cDNA,经SfiI酶切并去除短片段之后,与经同样酶切的pGADT7-SfiI载体连接,利用电转法将重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中,获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒。结果得到库容量大于2.0×10⁶的初级文库,检测表明文库cDNA插入片段长度主要分布在700~2 000 bp,文库重组率为87.5％。结果表明,该文库质量较好,可用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验,本研究为开展病毒与寄主互作的研究奠定基础。     

高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备

高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)是世界上分布最广的侵染甘蔗的病毒之一,引起甘蔗花叶病,对甘蔗产业危害很大。根据SrMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列合成一对引物,以海南(SrMV-HN)染病植株总RNA为材料,采用RT-PCR方法克隆了长约987 bp的目的片段。将CP基因与质粒pET32a(+)连接,构建了含SrMV CP基因的融合蛋白原核表达载体pET32a-SrMVCP。然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测出一条约36kD的特异融合蛋白表达谱带。融合蛋白主要以可溶性蛋白形式稳定表达。通过优化诱导条件,确立了CP基因表达的最佳条件:IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为30℃。用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清。通过酶联法(ID-ELISA)测定本试验制备的SrMV CP抗血清工作浓度为1∶1 000,Western blotting检测结果表明,抗血清与SrMV-HN诱导表达的CP蛋白发生特异性反应。对田间25个甘蔗样品进行检测,结果表明该抗血清的效价高、灵敏度高、特异性强,可以应用于田间样品的检测。     

海南地区番木瓜花叶病病原的分子鉴定与多样性分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)和番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)是热带、亚热带地区严重威胁番木瓜农业生产的主要病害。本研究对27份疑似番木瓜花叶病病叶样品进行分子鉴定,提取病叶总RNA,反转录获得对应的cDNA,根据PRSV病毒的CP、P1、Hc-Pro和NIb基因序列和PLDMV病毒的CP基因序列设计特异性引物进行PCR检测和测序分析。研究发现PRSV感染20例(74.1%),PLDMV感染3例(11.1%),PRSV和PLDMV交叉感染的样品1例(3.7%)。多样性分析结果表明,海南地区PRSV病毒存在3个株系,株系之间出现明显分化;海南地区PLDMV病毒与日本和台湾地区报道的PLDMV病毒株系有共同的起源。研究结果表明PRSV和PLDMV是海南地区番木瓜花叶病的主要病原,其中PRSV病毒3个株系之间P1基因同源性在95%以下,这可为后续研究构建抗PRSV和PLDMV的双价表达载体提供数据支持。     

玉米螟P450基因cDNA的克隆及植物次生物质对其诱导表达

昆虫细胞色素P450是一类在生物代谢中起重要作用的基因家族,承担着许多重要的生 理功能,包括对植物次生物质代谢和杀虫剂解毒等.本研究以玉米螟5龄幼虫中肠的总RNA为 模板,根据不同昆虫P450基因家族保守氨基酸序列,设计并合成简并引物,利用RT-PCR扩 增出了玉米螟细胞色素P450基因cDNA片段,将其克隆到pMD19 T载体进行序列测定.测序获得了编码213个氨基酸残基的641 bp的DNA片段,命名为OfP450(GenBank登录号：EU807990) ;与已公布的棉铃虫、家蚕、欧洲防风草结网毛虫、小菜蛾和黑腹果蝇等的细胞色素P450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为55％、50％、49％、44％和31％.将植物次生物质棉酚、丁布添加入人工饲料中,对玉米螟进行了饲喂实验,采用优化半定量RT-PCR,以18S rRNA为内标,RT-PCR检测进食棉酚、丁布植物化合物的玉米螟中肠P450基因的转录. 结果表明,其转录水平能被棉酚、丁布显著诱导. 提示本实验克隆的玉米螟细胞色素P450对植物次生物质的代谢作用与P450表达量呈正相关.该研究为下一步将植物介导的RNA干扰技术应用于害虫生物防治提供坚实的基础.     

新疆盐生植物车前PmNHX1基因的克隆及生物信息学分析

盐分对植物的伤害主要是Na+引起的,而Na+/H+逆向运输蛋白催化Na+/H+逆向跨膜运输,从而使质膜上Na+运出细胞和液泡膜中的Na+区隔化。这是植物尤其是盐生植物抵御盐胁迫的主要方式之一。根据不同植物编码液泡膜逆向运输蛋白基因的保守序列,设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,首次从新疆盐生植物车前（Plantago maritima）中克隆到Na+/H+逆向运输蛋白基因的cDNA全长2464 bp,命名为PmNHX1(GenBank登录号：EU233808),该基因编码区长为1 662bp,编码553个氨基酸,理论分子量为61.16kDa,等电点为7.22。数据分析结果显示,该蛋白质主要定位于液泡膜上,由12个序列保守的跨膜结构域组成,其中TM3跨膜结构域上存在“LFFIYLLPPI”-氨氯吡嗪咪结合域,并且该位点与Na+有竞争作用。PmNHX1逆向运输蛋白与其他植物逆向运输蛋白的氨基酸同源性为64％~80％。通过生物信息学方法对其理化性质和功能分析进行预测,这为进一步研究转耐盐基因PmNHX1及其功能鉴定奠定了基础。     

花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因克隆及细菌双杂交诱饵质粒构建

初步分析植原体免疫膜蛋白的结构,以Imp构建诱饵质粒,为研究植原体与寄主互作的分子机理,探讨植原体传播、侵染及在寄主内的运输方式奠定基础。根据本实验室获得的花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因序列设计特异性引物Imp-F/Imp-R,通过PCR扩增获得花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因,大小519 bp,编码蛋白含有172个氨基酸残基,与SPWB膜蛋白的核苷酸差异一个碱基,氨基酸序列相同。另外与WBDL膜蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.8%和70.2%。对其进行系统发育树分析;初步分析imp基因编码蛋白的跨膜区和疏水区。分析结果表明：花生丛枝植原体免疫膜蛋白C端有一跨膜锚定区,N端主要为膜内亲水区,没有前导信号序列。预测花生丛枝植原体免疫膜蛋白是一类C端跨膜的植原体免疫膜蛋白。将imp基因克隆到带有λcI基因的pBT质粒上,构建诱饵载体pBT-Imp,并通过IPTG诱导表达,western blot检测和自激活检验对其进行检测。结果显示：所构建的诱饵载体pBT-Imp可用于细菌双杂交的进一步实验。     

辣椒脉斑驳病毒文昌分离物基因组测序及分析

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫.本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物(ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC)的基因组.分段克隆的测序结果通过拼接,共获得ChiVMV-WC基因组9 717个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号:GQ981316).在核苷酸序列的第164位~第9 270位存在一个大的开放阅读框(ORF),编码一个多聚蛋白(分子量为350.44 kD).近年来被证实的马铃薯Y病毒科的一个新的ORF (pretty interesting potyviridae ORF,PIPO)存在于ChiVMV-WC基因组核苷酸序列的第2 892位~第3 110位,编码一个由72个氨基酸聚合而成的多肽(分子量为8.26 kD).ChiVMV-WC与ChiVMV其它分离物的基因组核苷酸序列比较发现该病毒存在着较高的变异率.本研究通过与同属内病毒的同源性分析以及系统进化树分析,确定了ChiVMV-WC在生物进化史上的地位.     

新牧一号杂花苜蓿MvNHX1基因的表达分析和提高烟草耐盐性的研究

提取新牧一号杂花苜蓿的总RNA,用特异引物RT-PCR扩增后的cDNA片段连接入pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α,对阳性克隆进行序列分析,新牧一号苜蓿NHX1（MvNHX1）全长1 626 bp,Genbank登录号为：EU375310。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR分析表明,在盐胁迫下MvNHX1基因的表达均上调。构建重组植物表达载体pBI121-MvNHX1后,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,转基因烟草在盐胁迫下发芽率和生物量均高于非转基因烟草,表明MvNHX1能够提高转基因烟草的耐盐性。     

甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

为提高甘蔗抗病性,本研究根据甘蔗黄叶病毒海南分离物ScYLV-CHN-HN1全基因组序列(GenBank no. HQ342888),利用病毒CP蛋白介导的RNAi技术,针对病毒外壳蛋白CP,设计两对含有酶切位点的特异性引物,CPsf1/CPsr1和CPasf1/CPasr1,以构建好的pMD19-T/CP质粒为模板,pRNAi1017为中间载体,分别合成构建干扰载体的正反向片段pRNAi-CP-F-R,将CP正反向片段分别插入表达载体pCAMBIA2300的相应位置,构建含有发卡结构的RNAi载体p2300-CP-F-R,经过PstⅠ酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体p2300-CP-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到12株阳性转基因植株,Southern blot杂交和半定量RT-PCR对其检测,证明干扰片段已经整合烟草基因组中并进行了转录,该结果为RNAi介导抗病毒甘蔗育种研究奠定基础。