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目的:研究CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达。方法:以质粒pBS1761为模板扩增TAP-tag片段,PCR产物经纯化后克隆在真核表达载体pTRE2-hyg上。再以pUK-CPSF30k、73k、100k为模板扩增CPSF基因片段,将其克隆在质粒pTRE2-hyg-TAP-tag中TAP-tag片段的下游,并将重组质粒转化入细胞株Hela Tet-offS3细胞内。结果:细胞抽提液经SDS PAGE电泳后进行蛋白质印迹杂交,胶片上出现野生型的CPSF条带和分子量较大的滞后条带。后者经分子量与分子标记对照,确系重组体TAP-tag-CPSF所表达的蛋白条带。结论:重组质粒pTRE2hyg-TAP-tag-CPSF30k,73k,100k在Hela tet-offS3内完好表达。 相似文献
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一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用 总被引:2,自引:0,他引:2
以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体,PCR合成ompT引导序列,插入该载体多克隆位点上游,构建了分泌型原核表达载体pTO—OT。将2个外源基因克隆至pTO—OT,2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达,表达量为25%~30%。Western印迹分析证实了重组蛋白在大肠杆菌中表达后可被信号肽酶有效识别,切割后的重组蛋白具有良好的免疫学活性。对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性,显示了该原核表达载体在基因工程中的应用价值。 相似文献
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随着DNA重组技术的发展,外源基因的表达问题受到越来越多的关注.常用的外源基因表达系统有原核表达系统和真核表达系统,两种表达系统各有优缺点.本文主要对这两类表达系统的研究进展、存在问题等做一概述. 相似文献
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利用PCR技术从含有IL-1ra的质粒上扩增IL-1ra基因,经过序列测定后插入表达载体pTIG-Trx,并转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。经SDS-PAGE分析显示,IL-1ra表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达产物出现相对分子量大约为17000的一条新生蛋白质带,其大小与预期结果一致,经Western和ELISA分析,证明该带即为目的蛋白,SDS-PAGE显示目的蛋白全部以可溶性蛋白的形式存在。超声破碎后,上清经金属螯和层析纯化获得纯度约为98%的蛋白样品。 相似文献
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应用植物表达系统生产疫苗的研究概况 总被引:3,自引:0,他引:3
随着重组DNA技术、植物转基因技术和分子植物病毒学的迅猛发展,使得应用植物作为疫苗抗原的表达载体成为可能。本对应用转基因植物和基于植物的病毒载体两种植物表达系统生产疫苗抗原的研究概况进行了评述。 相似文献
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构建Rab9 GTPase siRNA表达载体,观察siRNA对哺乳动物细胞内Rab9 GTPase表达的抑制作用,为应用Rab9 GTPase siRNA表达载体进行抗麻疹病毒感染研究奠定基础。根据Rab9 GTPase基因的mRNA序列设计合成2对靶向Rab9 GTPase基因的寡核苷酸,克隆到表达载体pSUPER.neo EGFP,通过双酶切和序列分析对重组表达载体进行鉴定。将鉴定为阳性的重组表达载体转染B95a细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western-blot)检测B95a细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白的表达水平。双酶切和序列分析表明成功构建了Rab9 GTPase siRNA表达载体,RT-PCR和Western-blot技术实验表明重组表达载体可显著抑制B95a细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白的表达(最高抑制率分别为89.4%±0.5%和87.6%±0.7%),而对照组则没有变化。结果表明,成功构建了Rab9 GTPase siRNA表达载体,该表达载体可有效地抑制Rab9 GTPase在哺乳动物细胞内的表达。 相似文献
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信号肽及其在蛋白质表达中的应用 总被引:3,自引:1,他引:2
分子生物学研究已进入后基因组时代,其中心任务是更多地关注基因组表达的蛋白质的结构和功能。由于基因功能最终通过其表达产物——蛋白质来实现,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质上。另外,在菌株、培养和发酵等逐渐成熟的条件下,构建高效的表达载体以提高外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。随着研究的深入,发现信号肽对蛋白质的定位有着非常重要的作用,使得信号肽的研究不仅具有重要的理论意义,而且也具有潜在的应用价值。就信号肽的结构和功能,信号肽的捕获方法及其在原核表达系统和真核表达系统中表达外源蛋白质的应用做一些介绍。 相似文献
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哺乳类细胞基因表达系统 总被引:1,自引:0,他引:1
通过适当的设计,可以构建在哺乳类细胞中表达的质粒,将其导入哺乳类细胞后,可以有效地表达外源基因.文章主要就这类质粒的特征、分类及其研究进展等方面予以综述. 相似文献
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目的:研究质粒表达载体中2个表达单元间相互位置和转录方向关系对表达的影响,找出利于2个表达单元表达的优化的相互关系。方法:以全抗体为研究对象,构建了轻重链方向不同的2种相互关系的单质粒表达载体pIRESdhfrA和pIRESdhfrB,转染CHO-dhfr-细胞后,对瞬时表达水平进行了比较。以pIRESdhfrA和pIRESdhfrB为基础,构建了瞬时表达载体pIRESdhfrA-sv40ori和pIRESdhfrB-sv40ori,在COS-7细胞中进行了瞬时表达水平的比较。构建了基于CHO定点细胞系的稳定表达细胞株,对pIRESdhfrA和pIRESdhfrB进行稳定表达水平的比较。结果:在CHO-dhfr-的瞬时表达水平比较中,pIRESdhfrB转染的细胞表达水平是pIRESdhfrA转染细胞的2.18倍。与pIRESdhfrA-sv40ori在COS-7细胞的瞬时表达水平相比,pIRESdhfrB-sv40ori是其表达水平的2.3倍。pIRESdhfrB-FRT构建的CHO定点细胞平均表达水平是pIRESdhfrA-FRT构建的CHO定点细胞的11.6倍。结论:在构建的真核细胞质粒表达载体pIRESdhfr中,2个表达盒的启动子头-头转录方向关系比头-尾方向关系更利于重组蛋白的表达。 相似文献
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烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)为Tobamovirus代表成员,以此病毒介导的外源蛋白在植物中表达,经过了十几年的研究和不断完善,已被证实为一种有效的表达外源蛋白的途径.这项技术已经在医用活性多肽以及疫苗的研制、功能基因的鉴定、植物体内生物合成途径的研究等方面发挥越来越重要的作用.重点阐述了TMV基因组RNA的结构和分子生物学特征,并着重对重组载体的构建及其利用加以了论述. 相似文献
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神经组织中基因特异性表达的调控是由顺式作用元件和反式作用因子相互作用完成的 ,所以 ,寻找并鉴定这些顺式作用元件就成为这一研究领域中不可缺少的一个环节。利用报告基因在体外培养细胞的瞬时表达实验寻找和鉴定顺式作用元件是广泛应用的重要手段之一 ,但这一方法有其明显的局限性 ,即( 1 )体外培养细胞脱离了整体动物发育和生长环境的调节 ;( 2 )体外构建的可能包含转录调控序列的报告基因表达载体使研究的片段脱离了整个基因组背景 ;( 3)报告基因表达载体在体外培养细胞瞬时表达的研究体系使基因表达脱离了可能作为转录起始开关调节因… 相似文献
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微生物脂肪酶的重组表达 总被引:1,自引:0,他引:1
微生物脂肪酶在传统和新型工业催化领域中的应用越来越广泛与深入。作为脂肪酶规模化制备主要途径的高效重组表达,为脂肪酶催化剂的最终形成及工业催化奠定了坚实的技术基础。概述并讨论了微生物脂肪酶重组表达的最新策略和发展趋势,阐述密码子优化、融合共表达、杂合启动子、同源高效表达、细胞表面展示和表达文库的高通量筛选等技术特点及其表达应用现状,指出细胞表面展示表达和表达文库高通量筛选体系为脂肪酶重组表达注入强劲活力;在此基础上对几种代表性微生物脂肪酶的重组表达进展作一综述,为微生物脂肪酶的重组表达研究及工业生产提供借鉴。 相似文献
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利用噬菌体PⅢ蛋白为载体对鹦鹉热衣原体单抗17筛选得到的B细胞抗原表位进行了研究,利用改构后的原核表达载体pQE30,构建含有B细胞表位基因的重组表达质粒,表达的蛋白经ELISA及Western Blot实验证实能够与单抗C17发生特异反应,蛋白免疫动物后得到了抗鹦鹉热衣原体的抗体,验证了所筛选表位的真实性。 相似文献
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在前期工作基础上,对汉坦病毒糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)的嵌合基因G2S0.7表达产物的免疫学特性进行进一步的研究。将汉坦病毒含有G2S0.7嵌合基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中融合表达并免疫BALB/c小鼠,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测免疫应答效果,以研究嵌合基因的免疫效果。结果表明,用该融合蛋白免疫小鼠,可诱导产生抗汉坦病毒NP及GP特异性的抗体,抗体效价分别为1:3200及1:200;同时融合蛋白还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应。说明汉坦病毒G2S0.7嵌合基因表达的融合蛋白既可刺激机体产生特异性的抗汉坦病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异性的细胞免疫应答,为进一步进行汉坦病毒基因工程疫苗的研究奠定了实验基础。 相似文献
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利用放射免疫分析(RIA)证实了含金鱼生长激素I cDNA的重组病毒在感染细胞96h后所表达的生长激素达到最高水平,平均每10^5个细胞可分泌金鱼生长激素I最高达288.07ng;平均每克干虫可产生金鱼生长激素I925.3μg。从感染重组病毒的无血清细胞培养基中纯化生长激素I,平均每毫升培养基可纯化具免疫活性纯度95%以上的金鱼生长激素I达664.224ng。纯化后蛋白的N-末端首20个氨基酸序列 相似文献