人博卡病毒编码蛋白功能研究

人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)是一类新发现的病毒,属于细小病毒科。至今己发现有4个基因型别(HBoV 1～4),不同基因型别的HBoV临床意义不同,有单一HBoV1感染致死的报道。但迄今为止,其复制机制、致病机理等尚不明确。HBoV基因组全长约为5.5kb,主要表达非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS4和NP1,以及结构蛋白VP1、VP2和VP3。本文旨在对近年来的HBoV各编码蛋白功能研究进展进行综述,并对HBoV未来可能的研究方向进行展望。     

人博卡病毒1型感染性克隆的构建及鉴定

人博卡病毒1 (human bocaparvovirus 1, HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一。其感染2−5岁婴幼儿,能引起轻度或重度急性呼吸道疾病,严重时可危及生命。HBoV1基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse, ITR),为病毒基因组复制所必需,但是难以进行PCR扩增合成。本研究通过分步合成末端ITR及分子克隆方法成功构建HBoV1的全长感染性克隆pSKHBoV1。经转染HEK293细胞后,分别从重要非结构蛋白的表达、病毒RNA转录后修饰与加工、病毒基因组复制水平以及子代病毒粒子基因组鉴定等方面,证实构建的感染性克隆在转染HEK293细胞后能够进入正常的复制周期并具有拯救出病毒粒子的潜力,这为后续研究HBoV1的复制增殖、病毒与宿主互作关系以及病毒疫苗的研发奠定了基础。     

猪博卡病毒环状附加体的发现与鉴定

为了证实博卡病毒可以环状附加体形式存在于宿主体内,本研究利用半巢式PCR方法在健康猪粪便标本中筛查出2株猪博卡病毒环状附加体PBoV_G2-episome和PBoV_G3-episome。通过反复测序和序列拼接得到其末端非编码区序列（405nt和511nt）。经过对其进行序列分析及二级结构的预测,发现PBoV_G2-episome与人博卡病毒3附加体（HBoV3-episome）结构相似,而PBoV_G3-episome与博卡病毒属其他成员的末端二级结构存在较大差别。猪博卡病毒环状附加体的发现证实了有些博卡病毒与其他细小病毒的复制方式存在一定差异,也为今后博卡病毒感染性克隆的构建提供了一条研究思路。     

人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析

为了解人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)VP1基因进化关系;阐明HBoV目前具体的变化规律,用PCR的方法扩增了1株HBoV的全基因和9株HBoV的VP1基因,克隆并测序,在此基础上,将HBoV的全基因序列和衣壳序列分别与细小病毒亚科其他14个有代表性的病毒进行遗传分析,构建进化树,对目前所有可得到的HBoV的17个衣壳蛋白进行二级结构分析和抗原性分析。结果显示:HBoV全基因序列与B19关系较远,但衣壳序列遗传关系较近。以有典型性的猫瘟细小病毒(Feline parvovirus,FPV)衣壳蛋白为参照,分析多个HBoV衣壳序列之间的变异情况,显示HBoV衣壳的二级结构基础表现出较高的保守性,序列之间的变化主要发生在高抗原区域和感染活性区域。衣壳病毒变异情况显示HBoV在稳定自身的情况下表现出一定的活跃性以逃避免疫反应,也表现出一定的感染适应力。     

家蚕细小病毒样病毒的研究进展

家蚕细小病毒样病毒(Bombyx mori parvo-like virus,BmPLV)是一种二分病毒,该病毒在家蚕中肠柱状细胞核内复制和包装,感染的细胞核呈现过分膨胀、细胞核孚尔根浓染等细胞病理学特征。病毒粒子直径20~24 nm,无囊膜呈球型。基因组为单链线性双分子DNA(VD1、VD2),分别独立包装在各自的衣壳中。病毒编码四个非结构蛋白NS1、NS2、NS3和pol(DNA聚合酶),一个主要结构蛋白VP及次要结构蛋白P133。其基因组末端反向重复序列可形成与BmPLV复制有关的"锅柄形"结构,以及含自身编码的DNA聚合酶的序列,推测该病毒与腺病毒复制方式相类似,依靠共价蛋白为起始物完成复制。     

人博卡病毒2基因组扩增及序列分析

为获得人博卡病毒2(Human bocavirus 2,HBoV2)基因组序列,以2010年HBoV2单阳粪便标本为材料,PCR方法扩增HBoV2基因组不同区域,经序列拼接后得到5444bp的全基因组序列(HBoV2-NC)。系统进化分析显示,HBoV2-NC与兰州株HBoV2亲缘关系最近;DINAMelt末端回文结构预测证实,HBoV2-NC 5′末端存在反向互补序列,具有典型的细小病毒末端的茎环样结构;接头法PCR扩增得到HBoV2-NC部分末端侧翼序列。     

SiRNA抑制柯萨奇B3病毒的复制和表达

目的 研究观察体外合成siRNA对培养HELA细胞中柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3,CVB3）的影响。方法根据siRNA靶序列设计原则,针对编码CVB3病毒聚合酶、VP1蛋白和5’非编码区基因组,特异性地体外合成三对siRNA,同时合成一对与CVB基因组序列无关的阴性对照siRNA。利用脂质体转染进入Hela细胞,用CVB3感染培养HELA细胞,观察转染后HELA细胞病变;采用RT-PCR技术检测感染CVB3各组的病毒RNA;用免疫荧光技术检测各组CVB3蛋白的表达;并用培养细胞上清液再感染HELA细胞观察病毒滴度。结果针对CVB3病毒聚合酶的siR-NA能有效的抑制病毒的复制和CVB3蛋白的表达,并能抑制病毒的再感染;而针对VP1蛋白和5’非编码区的siRNA能部分抑制病毒的复制和CVB3蛋白的表达。结论我们设计合成针对编码CVB3病毒聚合酶基因组的siRNA能有效抑制CVB3病毒复制和表达。     

人博卡病毒2型VP1U突变对sPLA2活性的影响

对HBoV2 VP1U蛋白进行原核表达并检测其sPLA_2活性,对其关键氨基酸进行突变,检测突变对sPLA_2活性的影响。构建重组质粒pMD18T-VP1U,选取VP1U蛋白4个关键氨基酸为突变点,分别进行原核表达,蛋白纯化后用sPLA_2试剂盒检测sPLA_2活性,对比突变前后VP1U蛋白sPLA_2活性有无变化。野生型HBoV2VP1U蛋白的sPLA_2活性为0.243μmol/min/mL,具有sPLA_2活性;突变体L19P、P21R、D42H及Y45N蛋白的sPLA_2活性分别为野生型蛋白的1.2%、1.2%、0.82%、0.41%。野生型HBoV2VP1U蛋白具有sPLA_2活性,突变体蛋白均几乎完全丧失了sPLA_2活性,提示19、21、42、45位4个氨基酸是维持sPLA_2活性的关键氨基酸。该研究为靶向抗病毒药物的研究提供了理论基础。     

国家自然科学基金项目简介

<正>项目名称:人博卡病毒(HBoV1)非结构蛋白NP1在病毒复制过程中的作用及其机制项目经费:80万项目主要内容:人博卡病毒HBoV1是近年被发现的可引起人类疾病的细小病毒,由于     

急性呼吸道感染儿童中WU多瘤病毒基因组序列特征分析

为了解从北京地区急性呼吸道感染儿童中发现的WU多瘤病毒的基因组编码特征,并对其进行基因序列多样性分析,应用针对基因组5'端非编码区、衣壳蛋白VP1、VP2编码基因以及LTAg编码基因的引物对,从已确证为WU病毒阳性的来自北京地区急性呼吸道感染儿童的编号为BJF5276的临床标本中经聚合酶链反应扩增得到预期的基因片段,直接测序后将序列拼接得到全基因组序列,进而推导其基因组编码特征;随后从其它21例已确证为WU多瘤病毒阳性的急性呼吸道感染儿童标本中扩增得到衣壳蛋白VP2编码区基因,进行基因序列测定以及基因序列多样性分析。得到了WU病毒BJF5276全基因组序列。序列分析结果显示WU病毒BJF5276基因组序列全长为5229bp,共有5个主要的CDS(Coding domain sequences),分别编码衣壳蛋白VP2、VP3、VP1,并以其互补序列为模板,编码STAg和LTAg;所得到的22例VP2蛋白编码区基因序列同源性比较结果显示病毒VP2基因编码区序列与GenBank中已有的64个序列之间同源性很高;Mega4.0NJ进化树(Neighbor-joiningtree)分析显示这22个VP2基因序列分属于不同的基因进化簇,其中20个序列属于进化簇I中的Ia,另外2个序列属于进化簇III,其中的一个序列在IIIb基因进化簇中,另外一个序列独立成簇,不属于现有的IIIa或IIIb,暂时将其命名为IIIc。本研究结果提示北京地区的WU病毒具有多瘤病毒科的基因组编码特性;序列非常保守,有分属于不同基因进化簇的WU病毒在北京地区流行,与文献报道的以Ib流行为主所不同的是北京地区的WU病毒以Ia为主,且有新的基因进化簇出现。     

野田村病毒RNA的复制机制

野田村病毒科Nodaviradae分为2个属,分别为主要感染昆虫的α野田村病毒属(Alphanodavirus)和主要感染鱼类的β野田村病毒属(Betanodavirus)。野田村病毒的基因组由2条单链正义RNA分子(RNA1和RNA2)所组成,RNA1编码蛋白A,即病毒负责复制病毒两条基因组的依赖RNA的RNA聚合酶催化亚基。RNA2编码衣壳前体蛋白α,此前体蛋白α先组装成原病毒粒子,再经历一次自我催化的成熟切割成2个病毒的衣壳蛋白β和γ,就成了成熟的有感染性的病毒粒子。在RNA复制过程中,从RNA1的3′末端会合成一个不被包装进病毒粒子的亚基因组RNA3。RNA1能在无RNA2的情况下自我复制,并持续地产生亚基因组RNA3,RNA3的合成采取的是提前终止机制。本文还介绍了野田村病毒复制的调节、非结构蛋白的功能和病毒复制在细胞内的定位。     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的b肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtA △VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtA △VP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。     

人乳头状瘤病毒复制机制的研究进展

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)DNA以游离和整合两种形式存在于感染细胞中。游离形式HPVs的复制依赖于上皮细胞的分化,病毒E1、E2蛋白和复制起始位点(origin,Ori)为复制必需元件,E1和E2蛋白与Ori结合起始病毒DNA的复制。随后,病毒DNA通过E2蛋白与Brd4(bromodomain-containing protein 4)等细胞蛋白的互作而与染色体结合,并随细胞分裂平均分配到子代细胞中。在肿瘤中,高危型HPVs的基因组通常以整合形式存在,并随细胞的增殖而复制。     

从急性腹泻儿童中检出的人博卡病毒2型的研究

为了调查北京地区急性腹泻患儿中人博卡病毒2型（HBoV2）的流行情况并了解这一病毒的基因组特征,本研究收集2010年11月至2011年10月到首都儿科研究所附属儿童医院门诊就诊的急性腹泻患儿的粪便标本553例,采用荧光实时PCR进行HBoV2 DNA的检测。选择2例病毒载量较高的阳性标本进行HBoV2各基因片段的扩增并测序。将所测到的序列进行拼接后得到完整的基因组序列并与GenBank中的相关序列进行比较分析。结果显示,553例粪便标本中共检出HBoV2阳性标本15例,阳性率为2.7%;各年龄组中,3~6月龄患儿中的HBoV2 DNA阳性检出率最高（4.1%）;所检年度中,7月份阳性检出率最高（7.0%）;15例HBoV2检测阳性的患儿年龄均在2岁以下,其中4例患儿同时检出了诺如病毒,3例患儿同时检出了轮状病毒,1例检出了腺病毒。经测序得到两株接近完整的HBoV2基因组序列BJQ19和BJQ390;序列分析表明,这两株序列的同源性为99.2%,与GenBank中的FJ375129同源性最高,分别为99.1%和99.2%,为典型的HBoV2。上述结果表明,北京地区部分儿童的急性腹泻可能与HBoV2感染相关,且HBoV2感染在低年龄组儿童中更为常见。     

牛血液中一株新型环状病毒的分离与全基因组序列分析

我们从广西壮族自治区哨兵动物牛上采集的血液样本中分离到一株病毒,暂将其命名为广西环状病毒(毒株号:V172/GX/2015)。病毒接种C6/36细胞后可产生明显的细胞病变,表现为细胞聚集、皱缩与脱落。高分辨率琼脂糖凝胶电泳显示,病毒基因组由10节段的双链RNA组成,在凝胶上呈现"3-4-3"的带型特征。通过全长cDNA扩增与高通量测序方法获取V172/GX/2015毒株的全基因组序列。病毒基因组大小为19 889bp,基因节段的大小在3 996bp(Seg-1)至829bp(Seg-10)之间,可编码VP1至VP7等7种结构蛋白以及NS1至NS3等3种非结构蛋白。对环状病毒属保守的VP1、VP3(T2)与VP7(T13)蛋白氨基酸序列分析与系统发育树分析显示,V172/GX/2015与蚊传播环状病毒Yunnan orbivirus、Peruvian horse sickness virus以及Mobuck virus具有较近的亲缘关系,氨基酸序列相似度在31.4%至69.9%之间;V172/GX/2015在系统发育树上形成了一个独立于其它环状病毒的进化分支。本研究首次报道了一种新型环状病毒在牛上的分离与全基因组序列,研究结果将进一步丰富我们对环状病毒属病毒的认知,为开展新型环状病毒的流行病学调查与致病性研究提供基础。     

杆状病毒部分功能基因的研究进展

杆状病毒以核型多角体病毒NPV的研究最为深入,到目前已有三种NPV的基因组全部测序：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）［1］、黄杉古毒蛾核型多角体病毒（OpMNPV）［2］、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）（GenBank accession no.L33180）。 　　杆状病毒基因组除编码病毒复制必需的基因及结构基因外,还编码一些有利于病毒充分增殖但对病毒复制并非一定必需的基因,这些基因在病毒的增殖过程中执行特定的功能,这类功能基因体现了杆状病毒的复制策略、病毒与细胞的相互作用关系,与杆状病毒宿主特异性的决定有关。本文综述了杆状病毒部分功能基因的研究进展。     

体外研究脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应系统的作用及其免疫学意义

尽管针对脊髓灰质炎病毒已经有长达数百年的研究并成功研制出了预防性疫苗,但是对于该病毒如何启动机体天然免疫反应,进而激活获得性免疫反应这一过程的具体分子机理仍有诸多空白。本研究通过体外分析脊髓灰质炎病毒Sabin减毒株Ⅰ型的结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应信号分子的影响,了解脊髓灰质炎病毒在上皮细胞中启动免疫信号的具体分子机制。采用PCR方法扩增脊髓灰质炎病毒四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,经酶切纯化后与pcDNA3.1+真核表达载体连接,分别构建含目的基因的四种重组质粒。将重组质粒分别转染至人呼吸道上皮细胞16HBE中,48h后收集培养上清、细胞。提取细胞的总RNA,利用Q-PCR法分别检测四种结构蛋白表达所诱导的天然免疫信号分子的mRNA表达量。同时,上清、细胞裂解物分别与人T细胞共培养,检测其对T细胞增殖的影响。体外在16HBE细胞中分别表达SabinⅠ病毒VP1～VP4四种结构蛋白均可刺激如LTα3、NIK等NF-κB天然免疫信号通路相关分子的表达,并且表达这四种蛋白的细胞裂解物与T细胞共培养后均表现出刺激T细胞非特异性增殖的效应。但是,仅有VP1、VP2表达所诱导分泌相关因子的培养上清才表现出间接刺激T细胞增殖的能力。SabinⅠ毒株的四种结构蛋白可激活NF-κB信号通路,促进T细胞的非特异性增殖,从而激活适应性免疫应答。     

HSV-1UL6基因编码门蛋白的结构及功能

门蛋白在单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的衣壳装配和基因组包装过程中扮演重要角色,对病毒的复制有重要作用。本文就HSV-1 UL6基因编码的门蛋白进行阐述,具体介绍形成门蛋白多聚体的影响因素,门蛋白及其周边蛋白的结构及功能,以及其靶点药物的研究现状等,以期为研究门蛋白在疱疹病毒感染和复制过程中的作用提供一定参考。     

水貂肠炎病毒山东株分离鉴定及生物学特性分析

【目的】本研究旨在研究水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)的基因组遗传进化特征。【方法】对采自山东境内水貂养殖场的109份水貂腹泻样品进行MEV的分离和鉴定,利用血凝和血凝抑制试验、多步生长曲线绘制以及蛋白的三级结构模拟等,对分离毒株生物学特性进行分析,通过重叠PCR对分离株进行全基因扩增,使用MegAlign进行序列同源性比对分析,利用DNAMANV6对基因组5’末端和3’末端回文结构进行预测,应用MEGAV6进行遗传进化分析。【结果】共分离得到5株病毒,经电镜观察和间接免疫荧光试验鉴定为MEV毒株,分别命名为MUTQS-1-5,GenBank登录号分别为OK275645、OK275646、OK275647、OK275648和OK275649;各分离株5’-和3’-UTR分别由长回文序列组成,具有典型的细小病毒基因组末端的茎环样结构,NS1和VP2基因的推导氨基酸序列存在多个非同义突变位点,其中NS1蛋白的E/Q545V位氨基酸突变,以及VP2蛋白的F267Y、Y324I位氨基酸突变为首次在MEV上发现;生物学特性分析表明,上述突变并未明显改变病毒的血凝及...