人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析

为了解人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)VP1基因进化关系;阐明HBoV目前具体的变化规律,用PCR的方法扩增了1株HBoV的全基因和9株HBoV的VP1基因,克隆并测序,在此基础上,将HBoV的全基因序列和衣壳序列分别与细小病毒亚科其他14个有代表性的病毒进行遗传分析,构建进化树,对目前所有可得到的HBoV的17个衣壳蛋白进行二级结构分析和抗原性分析。结果显示:HBoV全基因序列与B19关系较远,但衣壳序列遗传关系较近。以有典型性的猫瘟细小病毒(Feline parvovirus,FPV)衣壳蛋白为参照,分析多个HBoV衣壳序列之间的变异情况,显示HBoV衣壳的二级结构基础表现出较高的保守性,序列之间的变化主要发生在高抗原区域和感染活性区域。衣壳病毒变异情况显示HBoV在稳定自身的情况下表现出一定的活跃性以逃避免疫反应,也表现出一定的感染适应力。     

中国内陆发现HCoV-HKU1感染及N和S蛋白基因序列及进化分析

了解冠状病毒HKU1在我国大陆地区的感染情况及N基因和S基因的编码特征。采用RT-PCR的方法对2005年10月~2006年1月收集的260例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物(NPA)进行了冠状病毒HKU1基因检测。将PCR阳性产物测序,并将所测序列在GenBank中进行比较分析。260份样本中共检测到2份冠状病毒HKU1阳性,阳性率为0.77%(2/260),且该2例冠状病毒HKU1阳性患者临床均表现为肺炎症状。扩增其中一株病毒N和S全基因,并进行测序,与GenBank中的冠状病毒HKU1参考株及冠状病毒科其它成员进行序列同源性和进化树分析,并对N和S蛋白的结构与功能进行了初步的预测分析。由此表明我国大陆地区存在冠状病毒HKU1感染,且可能与儿童下呼吸道感染存在相关性。     

儿童急性呼吸道博卡病毒感染

了解博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)在我国儿童急性呼吸道疾病中的感染情况。采用PCR扩增的方法对2005年10月~2006年1月收集的72例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirates,NPA)进行了HBoV基因检测。将PCR阳性产物进行TA克隆,测序,并将所测序列与GenBank中HBoV序列进行比较分析。72份标本中共检测到6份HBoV阳性扩增产物,阳性率为8.3%(6/72),该6例HBoV阳性患儿临床均有肺炎或支气管肺炎症状。由此可以初步看出HBoV可能也是儿童急性呼吸道感染中较为重要的一个病原,且可能与儿童急性下呼吸道感染存在相关性。     

5-Aza-dC在mES细胞向生殖细胞分化中的DNA甲基化调控机制

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)向生殖细胞(Embryonic germ cells,EG)分化过程中5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC) 对DNA甲基化转移酶Dnmt1和Dnmt3a及生殖细胞特征基因Mvh表达变化的DNA甲基化调控机制。方法:将mES细胞分化形成拟胚体(embryoid bodies, EBs) 作为向生殖细胞分化的启动步骤,采用不同浓度(0.05μmol/L,0.1μmol/L,0.5μmol/L,1μmol/L,3μmol/L)处理EBs,RT-PCR实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测检测在5-Aza-dC处理前后Dnmt1和Dnmt3a在ES细胞和EBs中的表达,甲基化特异性PCR(MSP)检测原始生殖细胞分化特征基因Mvh启动子甲基化状态。结果: 5-Aza-dC的浓度在0.05 μmol/L~1 μmol/L之间时,EBs保持较高的存活率而EBs的形态明显发生了变化;5-Aza-dC 处理后, Dnmt1和Dnmt3a在EBs中mRNA表达量明显降低,其变化特点与WB结果相一致。MSP和测序结果显示, Mvh启动子区表现为部分甲基化,5-Aza-dC 处理后的4d EBs中Mvh CpG岛有4个CG位点发生突变,而mES细胞中未见突变。结论: EBs经5-Aza-dC处理后,Dnmt1和Dnmt3a的表达明显下调;同时,Mvh启动子发生部分甲基化,有可能启动了向生殖细胞的分化进程。     

流感病毒神经氨酸酶广谱抑制多肽的筛选研究

以纯化的流感病毒颗粒H1N1、H3N2为靶点对噬菌体展示的随机12肽库进行了筛选。经ELISA、神经氨酸酶抑制活性鉴定,获得52个阳性噬菌体克隆。根据测序和氨基酸序列分析,挑选出不同克隆间同源性最高的6条多肽进行化学合成。神经氨酸酶抑制活性实验显示,6条多肽中54-N1和69-N2的抑制活性最强,对N1、N2和乙型流感病毒三种流感病毒神经氨酸酶均有明显的抑制活性,54-N1的IC50值为7.486~14.693μmol/L,69-N2的IC50值为6.605~13.007μmol/L。同时,54-N1和69-N2可抑制流感病毒在MDCK细胞中的生长。病毒空斑抑制实验显示,54-N1和69-N2可明显抑制空斑形成的大小和数目。通过分析,54-N1的IC50值为18.38~31.76μmol/L,69-N2的IC50值为16.56~25.49μmol/L。两条多肽的浓度在高达10mmol/L时仍对细胞无任何毒性。54-N1和69-N2作为新的流感病毒神经氨酸酶抑制剂,与现有NA抑制剂Oseltamivir进行了比较和讨论,为进一步研制局部应用的广谱抗流感病毒的鼻腔喷雾剂奠定了基础。