组织型转谷氨酰胺酶的研究进展

组织型转谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase,tTG,TGⅡ）是转谷氨酰胺酶家族成员之一,作为一种多功能的蛋白质,具有催化蛋白质谷氨酰胺残基与赖氨酸残基交联的活性,还能结合和水解GTP,在胞内和胞外产生多种功能,最初由于tTG在细胞凋亡中所起的重要作用而受到研究者的关注,最近的研究更表明它在细胞分化,基质的稳定、伤口愈合、信号转导、动物发育等许多生理和病理过程中起着重要作用,因而受到越来越多的研究。     

“微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶”通过鉴定

具有“2 1世纪超级粘合剂”美称的谷氨酰胺转胺酶 (蛋白质 谷氨酸 γ 谷氨酰胺转移酶 ,ＥＣ2 .3 .2 .1 3 ) ,是一种可生产出满足人们需求的新型蛋白食品的重要酶制剂。它能够催化蛋白质分子内的交联、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰基的水解 ,因而在食品工业、化妆品工业和制药工业中具有广泛的用途。源于动物的谷氨酰胺转胺酶价格较高 ,采用发酵法生产可望大幅度降低其生产成本 ,故而是拓宽谷氨酰胺转胺酶应用范围的根本途径。在日本 ,谷氨酰胺转胺酶已成为食品工业的第二大酶种 ,其用量仅次于α 淀粉…     

谷氨酰胺转胺酶—理化性质，生产方法及其在食品工业中的应用

谷氨酰胺转胺酶（蛋白质－谷氨酸－γ谷氨酰胺转移酶EC2,3,2,13）催化体外大多数食品蛋白质的交联反应,如：酪蛋白,大豆蛋白,肌球蛋白,肌动蛋白,谷蛋白,禽蛋蛋白等等。通过催化肽键谷酰胺基残基的酰基转移反应,在各种蛋白质分子之间或之内形成ε-（γ-谷胺酰）赖氨酸键,从而改善各种蛋白质的功能性质,如：营养价值,质地结构,口感,贮存期等等。目前,商业化谷氨酰胺转胺酶主要从动物组织中提取,但由于其分离和纯化过程较复杂,且来源稀少,因而价格昂贵,近年来,人们开始转向于研究利用微生物发酵来生产谷氨酰胺转胺酶,并使之应用于食品工业,经过微生物谷氨酸酰胺转胺酶处理后的食品,其功能性质明显改善,本文就谷氨酰胺转胺酶的国内外研究现状作一综述,主要包括理化性质,生产及其应用。     

微生物谷氨酰胺转胺酶的表达及分子改造研究进展

微生物谷氨酰胺转胺酶具有催化蛋白质和某些非蛋白物质交联的功能,被广泛应用于食品、医药及纺织等领域.为提高该酶的产量及建立相应的分子改造平台,上世纪90年代日本味之素公司便开展了微生物谷氨酰胺转胺酶重组菌构建的研究.目前,该酶已在多个表达系统中实现活性表达,部分重组菌较野生菌的产酶能力有显著提高.近年来,谷氨酰胺转胺酶的分子改造研究也取得了初步进展,酶的催化活力、热稳定性及底物专一性得到提升.文中对上述研究中涉及的蛋白质表达及改造策略进行了简要的总结及分析,并指出相关研究的发展趋势.     

谷氨酰胺转胺酶—理化性质、生产方法及其在食品工业中的应用

谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ谷氨酰胺转移酶EC2.3.2.13)催化体外大多数食品蛋白质的交联反应,如:酪蛋白,大豆蛋白,肌球蛋白,肌动蛋白,谷蛋白,禽蛋蛋白等等。通过催化肽键谷酰胺基残基的酰基转移反应,在各种蛋白质分子之间或之内形成ε-(γ-谷胺酰)赖氨酸键,从而改善各种蛋白质的功能性质。如:营养价值、质地结构、口感、贮存期等等。目前,商业化谷氨酰胺转胺酶主要从动物组织中提取,但由于其分离和纯化过程较复杂,且来源稀少,因而价格昂贵,近年来,人们开始转向于研究利用微生物发酵来生产谷氨酰胺转胺酶,并使之应用于食品工业,经过微生物谷氨酰胺转胺酶处理后的食品,其功能性质明显改善。本文就谷氨酰胺转胺酶的国内外研究现状作一综述,主要包括理化性质、生产及其应用。     

丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原

以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的基因组DNA为模板,PCR扩增出转谷氨酰胺酶酶原基因(pro-transglutaminase,pro-TG)),PCR产物连接到pMDl8-T克隆载体后亚克隆到表达载体pET-22b(+),转化到表达宿主大肠杆菌BL2l(DE3).重组大肠杆菌经IPTG诱导后,转谷氨酰胺酶酶原(pro-TG)主要以可溶性蛋白表达.菌体离心后用丙酮高速搅拌破碎细胞,亲和层析成功地纯化到了转谷氨酰胺酶酶原.转谷氨酰胺酶酶原经胰蛋白酶切割激活后其酶活为502.8 U/g CDM(菌体干重).采用BSA交联试验证实成熟的转谷氨酰胺酶(TG)具有功能.采用丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原对大规模工业化生产转谷氨酰胺酶进行了有益的探索.     

添加CTAB促进吸水链霉菌产谷氨酰胺转胺酶

研究了添加十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）对吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）合成谷氨酰胺转胺酶的影响。结果表明,添加CTAB可以提高发酵过程中谷氨酰胺转胺酶的酶活,摇瓶培养中,CTAB的最佳添加时间和添加量分别为32h和1%,发酵终了时,谷氨酰胺转胺酶酶活最高达5.04u/mL,比对照提高了21.8%。初步研究表明,CTAB的主要作用是促使谷氨酰胺转胺酶的酶原转化为成熟酶,因此,在发酵过程中添加适当浓度的CTAB,可使酶原快速、完全地转化为成熟的MTG,解除酶原的产物抑制作用,促进了细胞产酶。     

医学研究中的转谷氨酰胺酶

在哺乳动物中,存在各种转谷氨酰胺酶,它们通过催化的酰基转移反应,使蛋白质发生修饰。它们参与了多种生理过程,同时和多种疾病相关,其中主要为炎症性疾病,神经退行性病变和肿瘤性疾病等三大类疾病。随着对其参与疾病的机理逐渐明了,转谷氨酰胺酶开始用于疾病的诊断和治疗 。     

分批发酵生产谷氨酰胺转氨酶的温度控制策略

微生物谷氨酰胺转氨酶 (Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ,简称ＭＴＧ ,ＥＣ2 3 2 13)由于能催化许多食品中蛋白质的交联反应 ,改善各种蛋白质的功能性质 ,在食品工业具有广泛的应用潜力[1] ,因而引起了人们的极大兴趣。谷氨酰胺转氨酶的生产通常采用从豚鼠肝脏或组织中提取 ,由于豚鼠肝脏或组织来源稀少 ,谷氨酰胺转胺酶的分离纯化过程复杂 ,因而价格昂贵。 2 0世纪 80年代末 ,Ａｎｄｏ和Ｍｏｔｏｋｉ等人[2 ,3 ] 首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的结果 ;近年来 ,Ｇｅｒｂｅｒ等人[4 ] 对其下游技术进…     

蛋白质交联用酶的作用机制及研究进展北大核心CSCD

蛋白质交联在食品、化工和医药等领域发挥重要的作用。利用酶催化蛋白质交联是一种可替代物理和化学交联的高效经济的方法。然而,目前仍缺乏详细的酶促蛋白质交联分子层面的解析。本文综述了酶催化的蛋白质交联反应机制及其对蛋白质结构的影响,以及在食品、化工和医药领域的应用,并展望了酶促交联的发展。     

甲壳动物血液凝固的分子机制

甲壳动物的防御机制完全依赖于非特异性免疫系统,血淋巴的凝固在宿主防御和阻止血淋巴渗漏中起重要的作用.甲壳动物的凝固酶的激活有两种独立的方式.在鳌虾中,依赖于Ca2+的转谷氨酰胺酶催化可溶性的凝固蛋白原转变成共价交联的凝固蛋白多聚物,不需要蛋白裂解反应.相反,在鲎中,位于淋巴细胞中凝固反应的所有因子都在受到脂多糖激活分泌到胞外,一系列的蛋白裂解反应使得凝固蛋白原转变成凝固蛋白,凝固蛋白间通过非共价的交联结合,而有转谷氨酰胺酶催化的凝固蛋白和淋巴细胞表面proxin间的结合则更加稳定了凝固蛋白反应.     

组织型转谷氨酰胺酶与肾脏纤维化

组织型转谷氨酰胺酶(tTG)是一个Ca2 依赖的具有转酰胺基作用的酶,它分布广泛,在许多生理和病理条件下发挥重要作用。近年来它参与组织纤维化的作用逐渐引起重视。tTG分泌到细胞外能够使很多细胞外基质蛋白成分之间发生交联,形成牢固结构,抵抗降解,从而促使细胞外基质沉积,促进组织纤维化发展。本文简要叙述tTG的分子特征和生理及病理学意义,并着重介绍tTG和肾脏纤维化的联系。     

谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶研究进展

谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶是生物．体内嘌呤产物合成途径的关键酶,负责催化全合成途径的第一步反应。肌苷属于嘌呤核苷,是食品和医药行业广泛应用的重要产品。谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶在肌苷的生物合成途径中起重要调节作用,对其深入研究将有助于提高肌苷的产量,对工业化生产有重大意义。本从谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的属性、功能、结构和基因表达与调控方面对其做了介绍,为肌苷产量的提高工作奠定了基础。     

组织转谷氨酰胺酶与神经退行性疾病

组织转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase,tTG)广泛分布于各种组织及细胞中,是一个多功能蛋白质。tTG能催化Ca^2 依赖的蛋白质交联反应,并在多种生物学过程中起到了重要作用,如细胞生长与分化、受体介导的胞吞作用、细胞黏附、细胞形态的维持以及细胞凋亡等。已有研究表明,tTG可能在多种神经退行性疾病的病理生理过程中起到了重要作用。现就近年来有关tTG与神经退行性疾病研究的一些进展做一介绍。     

蛋白质谷氨酰胺酶成熟肽基因mpg原核表达及其多克隆抗体的制备

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,简称PG)是一种新型蛋白质脱酰胺酶,在蛋白质改性领域具有广阔的应用前景。但是,目前关于蛋白质谷氨酰胺酶的测定方法主要是通过苯酚-次氯酸盐反应测定铵离子含量指示蛋白质谷氨酰胺酶的酶活,该方法精确度和灵敏度有限。因此,利用原核表达系统表达解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)分泌的蛋白质谷氨酰胺酶成熟肽基因mpg,纯化后制备其多克隆抗体用于检测解朊金黄杆菌分泌的蛋白质谷氨酰胺酶的含量。首先以解朊金黄杆菌基因组为模板扩增出成熟肽基因mpg,将其与pET32a载体连接构建重组质粒pET32a-mpg,转化至大肠杆菌BL21(DE3)。在25℃条件下,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h,目的蛋白表达量最高、呈可溶性蛋白。通过Ni-NTA柱纯化的重组蛋白mPG-His_6,将其作为抗原,免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测其效价,所得抗体效价为1∶5 000。蛋白质免疫印迹实验结果说明,该多克隆抗体特异性良好。最后使用该多克隆抗体对解朊金黄杆菌的发酵上清液进行蛋白质免疫印迹反应,检测天然蛋白质谷氨酰胺酶,结果表明该抗体特异性良好,可用于检测解朊金黄杆菌分泌的蛋白质谷氨酰胺酶,为深入研究蛋白质谷氨酰胺酶的生物学功能、建立蛋白质谷氨酰胺酶高产菌株的高通量筛选方法奠定了基础。     

转谷氨酰胺酶的分子生物学与基因工程

来源于微生物特别是轮枝链霉菌的转谷氨酰胺酶是一种重要的酶制剂,在食品工业中有着广泛的应用前景。本综述了近年来对转谷氨酰胺酶的分子生物学研究成果,以及对其进行基因工程改造的最新进展,讨论了其进一步的研究发展方向。笔认为采用基因工程生产重组转谷氨酰胺酶是解决目前酶价高昂和来源困难问题的一个大有希望的办法。     

添加胰蛋白酶促进Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062产谷氨酰胺转胺酶

研究了添加胰蛋白酶对Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062合成谷氨酰胺转胺酶的影响。结果表明,添加胰蛋白酶可以提高发酵过程中谷氨酰胺转胺酶的酶活。摇瓶培养中,在发酵起始时添加200U/ml的胰蛋白酶,谷氨酰胺转胺酶的酶活最高达到了6.61U/ml,比对照提高了27.1%。初步研究表明,添加胰蛋白酶可以直接切割发酵过程中产生的酶原,使其被快速地转化为成熟酶,因此推测胰蛋白酶提高谷氨酰胺转胺酶酶活的原因是解除了酶原的产物抑制作用,产生更多的酶原,从而促进了产酶。     

谷氨酰胺转氨酶对喷雾干燥蛋清粉凝胶硬度的影响

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)通过交联作用,能有效提高蛋白质的性质,进而提高食品的特性.蛋清粉的凝胶性质主要由蛋清中蛋白质(egg white protein,EWP)提供.因此,本研究通过在蛋清液中添加TGase,对蛋清液进行酶处理,经喷雾干燥得到蛋清粉.将所得蛋清粉与蒸馏水以一定比例复溶后测定其凝胶强度,经单因素实验和响应面实验设计对高凝胶强度蛋清粉工艺条件进行筛选,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析TGase对蛋清粉凝胶强度影响的作用机理.研究结果表明:当酶作用pH值为7.05,酶作用温度为34.89℃,酶作用时间为85.73 min,TGase添加量为3.40 U/g蛋白质时.所得蛋清粉凝胶强度最大,为(800.365±5.237)g,比空白组提高了 53.95％.通过SDS-PAGE电泳分析可得出结论:一定的TGase处理可使部分EWP发生分子内和分子间的交联,形成相对分子量较大的蛋白质分子,使蛋白质的结构更加紧密,并增加蛋白质对水分子的吸附能力,因此使蛋清粉硬度显著增强.     

枯草杆菌谷氨酰胺转胺酶的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

利用PCR技术 ,从枯草杆菌DB40 3染色体上扩增出谷氨酰胺转胺酶基因 ,将其克隆到大肠杆菌载体pET32a( + )中 ,成功构建谷氨酰胺转胺酶表达载体pET32-BTGase ,并转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。重组克隆在IPTG诱导下 ,表达出硫氧还蛋白 谷氨酰胺转胺酶 (Trx-BTGase)融合蛋白 ,表达量占细菌总蛋白量的 2 6%。利用金属螯合层析纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白 ,纯度超过 80 %,再通过分子筛层析进一步纯化得到融合蛋白纯品。酶活性分析表明表达的Trx-BTGase融合蛋白具有交联蛋白的活性 ,并发现Trx-BTGase融合蛋白和经凝血酶酶切后得到的BTGase单体都能催化牛血清白蛋白的聚合反应     

课堂教学随笔:谷氨酰胺的氨基

氨基代谢是《生物化学》中"氨基酸代谢"教学的重要内容,谷氨酰胺氨基的去向和利用是其中的重点之一。谷氨酰胺既有α-氨基又有酰胺基,其代谢由不同的酶分别催化,涉及转氨酶、酰胺基转移酶、谷氨酰胺酶、转谷氨酰胺酶等。不同代谢酶作用的基团和机理不同,学生容易混淆它们的作用。本文拟通过讨论几种谷氨酰胺氨基相关代谢酶的作用特点,指导学生掌握谷氨酰胺氨基的代谢。