发酵工程实验的改革与实践

传统的发酵工程实验在实验内容和组织形式等方面需要进行改革探索。参照工业酶制剂的生产流程, 集中2周时间开设综合性的大实验, 学生分组自行设计、准备实验, 实验过程中自我协调管理, 实验成绩自评与他评相结合。改革后的实验充分激发了学生的学习兴趣, 调动了学生的积极主动性, 训练了团队协作精神, 取得了良好的教学效果, 并对存在的问题提出了进一步完善的设想。     

转谷氨酰胺酶的分子生物学与基因工程

来源于微生物特别是轮枝链霉菌的转谷氨酰胺酶是一种重要的酶制剂,在食品工业中有着广泛的应用前景。本综述了近年来对转谷氨酰胺酶的分子生物学研究成果,以及对其进行基因工程改造的最新进展,讨论了其进一步的研究发展方向。笔认为采用基因工程生产重组转谷氨酰胺酶是解决目前酶价高昂和来源困难问题的一个大有希望的办法。     

常压室温等离子体(ARTP)诱变茂源链霉菌菌株

采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术处理茂源链霉菌（Streptoverticillium mobaraense）菌株HS47的孢子,选育微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）高产菌株。菌株的致死率强度和正突变率高低结果表明,在电源功率为120W,处理距离2mm,工作气流量10slpm时,等离子体氦气对茂源链霉菌HS47孢子的最佳处理时间为30s。将诱变后的孢子液稀释涂布后,利用96孔板高通量筛选方法对单菌落进行初筛,选出高产的突变株进行两轮试管复筛,筛选过程中保持对菌株的分离纯化,最终获得一株高产菌株M-8,其MTG酶活由2.8U/ml提高到5.1U/ml,较出发菌株HS47提高了82%。该菌株的摇瓶发酵实验证明,其酶活的提高是单位菌株分泌的MTG有所增加的结果。经过8次传代,证实该菌株具有良好的遗传稳定性。这为谷氨酰胺转胺酶的工业化生产提供了菌种支持和理论支持。     

产纤维素菌株的分离鉴定及产量相关性

【背景】细菌纤维素是一种性能优异的新型天然生物纳米材料,但其发酵产量低、生产成本高,尚未得到大规模生产与应用。【目的】自然选育细菌纤维素高产菌株,并探索菌株产量与菌落形态、水果来源、菌株种属之间的关联。【方法】从15个不同种类的576份腐烂水果中自然选育产纤维素菌株,并按菌落形态进行分类。静置培养筛选高产纤维素菌株,并对所得菌株进行16SrRNA基因测序,鉴定其种属。【结果】获得134株产纤维素菌株,其中一株分离自芒果的汉氏驹形杆菌(Komagataeibacter hansenii)产量最高,为11.24 g/L。所得菌株按菌落形态可分为10个类别,高产纤维素菌株形态共同特征为黄色、圆形、边缘整齐或不规则、表面粗糙或褶皱、凸起(形态4、5、9)。苹果和梨来源中分离得到的菌株菌落形态多样性丰富,高产纤维素菌株的水果来源中芒果所占比值最高,其次为梨和苹果。所有菌株鉴定为5个属13个种,包含了醋酸杆菌属(Acetobacter)、驹形杆菌属(Komagataeibacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)和乳酸杆菌属(Lactobacillus),其中高产纤维素菌株集中分布于汉氏驹形杆菌(K.hansenii)和中间驹形杆菌(K.intermedius)。【结论】筛到的菌株多样性丰富,并且得到多株高产纤维素菌株,其传代稳定性好,丰富了细菌纤维素生产菌株的来源。分析所得菌株产量与菌落形态、水果来源之间的关系可以为今后菌株筛选工作提供参考。     

基因组重排筛选高产谷氨酰胺转胺酶菌株

谷氨酰胺转胺酶(TGase)的产量不足的问题一直限制其工业化生产规模,故采用基因组重排的方法,筛选高产谷氨酰胺转胺酶菌株。通过对不同制备条件下原生质体纯度和形成率的考量,获得制备原生质体的最优条件为以6mg/ml的溶菌酶浓度进行酶解,酶解时间2h。再优化融合条件,以2min紫外灭活和40min热灭活结合的方法挑选出融合子。通过两轮基因组重排,经过96孔板发酵高通量筛选和摇瓶发酵复筛验证,获得了一株产酶达7.12U/ml的茂源链霉菌,相比最初选用菌株的平均酶活提高65.5%。发酵结果显示,酶活提高的原因可能是在重组后原酶成熟更快、更彻底,且得到的菌株遗传稳定性良好。证明基因组重排能够有效提高菌株的产酶水平,同时为谷氨酰胺转胺酶产量提高提供理论依据。     

甲壳素促进茂源链霉菌发酵产酶

为了提高茂源链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的产量,研究了甲壳素对茂源链霉菌发酵产酶的影响。结果表明,添加0.5%的甲壳素对茂源链霉菌发酵产酶的促进效果极显著,但甲壳素的添加量达到2%时反而会抑制菌株产酶。从菌株生长代谢过程中p H变化、产酶情况、发酵液中蛋白含量及总氮含量等方面,对甲壳素促进茂源链霉菌发酵产酶的作用机理进行了初步探讨。研究显示,甲壳素在茂源链霉菌发酵过程中对菌体生长产生一定的胁迫,刺激菌体大量分泌次级代谢产物,从而提高茂源链霉菌的产酶。对菌株发酵过程的显微观察则表明,甲壳素也可能通过分散菌体生长,提高菌体向胞外分泌谷氨酰胺转胺酶的量来促进产酶。     

蛋白质谷氨酰胺酶的发酵及初步分离和应用研究

研究了不同发酵条件对于产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）生产蛋白质谷氨酰胺酶能力的影响,酶的分离和初步的应用。通过考察种子的生长曲线,发酵的温度、转速、摇瓶装液量,碳源和氮源,得出最大产酶能力的发酵条件为：30℃,200r/min,装液量25ml/250ml,蔗糖为碳源,多聚蛋白胨为氮源,发酵10~12h。初步分离研究表明在4倍超滤浓缩和4倍乙醇沉淀条件下,酶活力回收率均为最高,分别为84.99%和76.07%。该酶与酪蛋白37℃温育2h时,酪蛋白的脱酰胺度为41.03%,到24h后,脱酰胺度不再增加,并且酪蛋白的溶解性也有所增加。     

基因工程菌在生物降解中的应用及其发展

在简要阐述基因工程菌构建方法的基础上,系统综述和评价了基因工程构建方法的研究进展及其在生物降解中存在的问题。     

phbC基因敲除对土壤杆菌产可得然胶的影响

本文构建了phbC基因无痕敲除菌株ΔphbC,分析了ΔphbC菌株生长代谢情况和产生的可得然胶在产量、凝胶性质和红外结构的变化。结果显示,ΔphbC菌株在发酵过程中氨基氮消耗情况与野生型菌株一致,在蔗糖消耗方面,ΔphbC菌株与野生型菌株在18 h之后出现显著差异,蔗糖消耗比野生型菌株明显降低。ΔphbC菌株可得然胶产量约24 g/L,相对于野生型菌株降低了45%;胶凝胶强度为812.521 g/cm^2,相对于野生型菌株降低了21%;红外结构与野生型菌株一致,无明显差异。phbC基因不影响菌体生长,不影响可得然胶结构,但是影响可得然胶的合成。     

海藻糖对微生物谷氨酰氨转胺酶热稳定性研究

本实验目的是研究海藻糖对微生物谷氨酰胺转胺酶（TGase）热稳定性的作用。糖类对TGase的保护作用根据糖种类不同有所差异,海藻糖和蔗糖的保护作用优于葡萄糖对TGase的保护作用。在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃下研究了海藻糖对TG酶的保护作用。结果表明,在50～65℃下海藻糖使谷氨酰胺转胺酶受热时的稳定性提高了约20％。海藻糖与酶复合的最合适浓度约为14％,浓度低时保护作用不明显,加入过高浓度的糖对酶的活性维持不利。50℃下处理一段时间内,海藻糖对酶的保护作用随时问变化很小。