A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,IPTG诱导目的蛋白高效表达,表达产物经Ni螯合亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论:构建了重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,原核表达获得高水平可溶性重组Bo NT/A LC,纯化得到纯度较高的蛋白质,重组Bo NT/A LC的酶活略高于A型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于Bo NT/A LC抑制剂高通量体外检测方法研究。     

C型肉毒毒素的制备及类毒素保护力初探

将C型肉毒梭菌经适宜条件的产毒培养后纯化,并进行相关鉴定。制备的C型肉毒毒素用分段脱毒法脱毒,并进行类毒素保护力的初步研究。以不同蛋白含量C型肉毒类毒素免疫小鼠后攻毒,结果显示,蛋白含量为0.625μg的类毒素免疫2针或蛋白含量为1.25μg的类毒素免疫1针均可保护50LD50的C型肉毒毒素攻击。蛋白含量为5μg的C型肉毒类毒素与福氏不完全佐剂配制的抗原免疫小鼠3次所得抗血清的保护力(Anti LD50/ml)为4.3×104。说明用该纯化工艺制备的C型肉毒类毒素具有很好的免疫原性,作为抗原成分用于C型肉毒疫苗和C型肉毒抗毒素的研究和生产具有较好的应用潜力。     

A型肉毒毒素中和抗体3D12的表达

目的:表达A型肉毒毒素(Bo NT/A)中和抗体3D12。方法:按哺乳动物偏好密码子设计合成3D12轻链(L)和重链(H)编码序列,分别连入L293、H293表达载体,共转染至HEK293细胞进行瞬时表达并纯化;通过ELISA检测3D12效价、3D12与Bo NT/A受体的竞争结合作用及与Bo NT/AHc的亲和力常数,通过Western印迹鉴定3D12的特异性。结果:得到轻链(L293-L)及重链(H293-H)表达载体;瞬时表达并纯化得到抗体3D12;ELISA结果显示3D12效价为1.22×106,3D12与Bo NT/A受体FGFR3、SV2C之间不存在竞争结合作用,3D12的亲和力常数K=10.6×108L/mol;Western印迹显示3D12与Bo NT/AHc能够特异性结合。结论:得到A型肉毒毒素中和抗体3D12,为肉毒毒素中和抗体的开发及阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

肉毒毒素作用机制的研究进展

肉毒毒素(botulinum toxin,BTX)是肉毒梭状芽胞杆菌在生长繁殖过程中产生的一种外毒素,其通过抑制神经递质的释放而引起肌肉松弛型麻痹。在世界范围内,肉毒中毒的案例时有发生,病情严重的患者最终因呼吸衰竭而死亡。肉毒毒素相关产品在临床痉挛性疾病、腺体分泌过度、神经性疼痛的治疗及美容除皱等领域展现出广阔的应用前景。因而,肉毒毒素作用机制的研究在肉毒中毒的治疗以及临床新适应症的开发等方面具有重要意义。就肉毒毒素跨越小肠上皮细胞屏障的吸收及神经毒性作用机制的研究现状作一概述。     

用骨制肉

众所周知,动物骨中含有65%的无机盐(磷酸钙,碳酸钙)、氯离子、钠离子等,其余为35%的以骨蛋白为主的有机物.骨蛋白是动物蛋白,肉的主要成分,也是动物蛋白,因此把骨转化为可食用的肉是可能的.     

E型内毒毒素的分子生物学研究进展

Ｅ型肉毒毒素不同于Ａ型肉毒毒素及具有蛋白分解性的Ｂ,Ｆ型肉毒毒素,具有自身的特点。本文就Ｅ型肉毒毒素的结构,激活及作用机制,Ｅ型肉毒毒素的精制特点,基因结构及酪酸梭菌产生Ｅ型肉毒毒素的机制探讨等四个方面予以介绍。     

肉毒毒素体外检测方法的研究进展

肉毒毒素是肉毒梭状芽胞杆菌在生长繁殖过程中产生的一种神经毒素,对人和动物具有强毒性和高致死性,在世界范围内,肉毒中毒的案例时有发生,病情严重者一般2~3 d即可死亡。肉毒毒素产品所用的体内检测方法(小鼠生物法)的结果变异系数大,不利于肉毒毒素产品含量的标准化控制。因而,建立准确且灵敏度高的肉毒毒素体外检测方法,在临床治疗及制品的质量控制方面都具有重要意义,现就常用的肉毒毒素体外检测方法作一阐述。     

E型肉毒毒素的分子生物学研究进展

Ｅ型肉毒毒素不同于Ａ型肉毒毒素及具有蛋白分解性的Ｂ、Ｆ型肉毒毒素,具有自身的特点。本文就Ｅ型肉毒毒素的结构、激活及作用机制、Ｅ型肉毒毒素的精制特点、基因结构及酪酸梭菌产生Ｅ型肉毒毒素的机制探讨等四个方面予以了介绍。     

成纤维细胞生长因子受体3胞外配体结合区的重组表达及其与A型肉毒毒素重链C端的相互作用

目的:实现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)胞外配体结合区FGFR3D23的表达与纯化,并鉴定其与A型肉毒毒素重链C端(Bo NT/AHc)的相互作用。方法:全基因合成的FGFR3D23基因片段经酶切连入p TIG(+)质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,获得的包含体经Ni2+柱纯化,透析复性后通过pull-down及ELISA检测纯化蛋白与Bo NT/AHc的相互作用。结果与结论:SDS-PAGE分析结果显示得到相对分子质量约27×103的蛋白特异表达条带,表达量为1.39 mg/L,包含体占73.4%;纯化和复性得到的目的蛋白纯度约96%,复性率约3%;pull-down及ELI-SA实验结果证明FGFR3D23可以与Bo NT/AHc特异性地相互作用。     

肉毒杆菌二元毒素和细胞外酶

对肉毒中毒和肉毒毒蛋白的研究已有近百年历史,肉毒杆菌神经毒素（ＢｏＮＴ）作用机制研究的进展已使它成分为分析神经递质释放的胞吐分子机制和用于临床治疗的有用工具。近年发现,肉毒梭状芽胞杆菌Ｃ和Ｄ型菌株除分泌ＢｏＮＴ外,尚合成另外两类与ＢｏＮＴ结构和生物活必完全不同的蛋白质,肉毒二元毒素和肉毒细胞外酶,它们分别影响细胞骨架和细胞的生长发育,也成为分析相关生命过程的有效工具药,本文综述了这两类蛋白质的有关     

浓缩蛋白聚糖方法的比较

蛋白聚糖(PG)单体是一个或多个氨基葡聚糖(GAG)链以共价键连接在核心蛋白上的复杂生物大分子,在体内PG单体又是以非共价键与HA(透明质酸)结合为聚合体。PG是动脉壁细胞间质的重要成分之一。它与胶原、弹性蛋白和细胞结合而将间质中的各个成份连结在一起,对维持动脉壁结构的完整性、通透性有非常重要的作用。由于它与动脉粥样硬化病     

B型肉毒毒素重链抗原表位的预测及表位合成肽抗原性的检测

目的:预测B型肉毒毒素蛋白抗原表位,研究表位合成肽的生物学活性。方法:利用生物信息学,结合Anthwine分析软件及网络平台,预测B型肉毒毒素蛋白重链的B细胞抗原表位。人工合成4条(P1,P2,P3,P4)表位多肽,与抗B型肉毒毒素类毒素的马血清反应;采用腹腔注射的方式用合成肽免疫BALB/c小鼠,检测免疫血清与合成肽的结合;对免疫小鼠腹腔注射B型肉毒毒素。结果:合成的多肽能与抗B型肉毒毒素的类毒素的马血清结合;多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体,其中P1、P3、P4产生的抗体对受毒素攻击的小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。     

小鼠神经母细胞瘤细胞株用于A型肉毒毒素重链体外实验的可行性研究

目的探讨小鼠神经瘤母细胞(Neuro-2a)细胞株用于A型肉毒毒素重链(Bo NT/A HC)体外细胞模型的可行性。方法对体外培养1~5 h的Neuro-2a细胞和经A型肉毒毒素(Bo NT/A)重链作用的Neuro-2a细胞(细胞接种于96孔培养板后随机分为对照组、0.01 nmol/L组、0.1 nmol/L组、1 nmol/L组和10 nmol/L组),进行Bo NT/A HC相关受体的检测,观察Bo NT/A HC作用不同时间(24、48及72 h)后Bo NT/A HC对细胞突起生长状况的影响,包括有突起细胞的百分比、细胞突起的长度以及突起总数。数据经Graph Pad Prism 5.0 One-way ANOVA分析。结果体外培养后Neuro-2a细胞表达高亲和力的突触囊泡蛋白2(SV2)和低亲和力的三涎酸神经节苷脂亚型1b(GT1b)受体。与对照组相比,Bo NT/A HC能明显促进Neuro-2a细胞突起再生及突起长度增加,其中0.1nmol/L Bo NT/A HC作用24 h后突起的Neuro-2a细胞百分比为(20.61±4.87)﹪高于对照组[(15.27±3.56)﹪,F=37.7,P0.001]、神经突起的总数量为(2.18±1.24)个高于对照组(1.68±0.99)个,(F=9.54,P0.001)、平均突起的长度为(38.76±38.11)μm,与对照组(23.38±27.13)μm相比差异无统计学意义;当Bo NT/A HC的浓度增加为1、10 nmol/L时,有突起的Neuro-2a细胞百分比分别为(15.08±5.27)﹪和(12.65±5.65)﹪,神经突起的总数量分别为(1.65±0.85)个和(1.64±0.85)个、平均突起的长度分别为(33.75±39.11)μm和(18.95±21.71)μm,与对照组相比差别不大,差异无统计学意义。随作用时间的延长(48 h和72 h)0.1 nmol/L组有突起细胞的百分比、细胞突起的长度以及突起总数与对照组相比均增高,且差异具有统计学意义,而1,10 nmol/L组中细胞变化差异无统计学意义。结论Neuro-2a细胞可用于Bo NT/A HC体外研究的细胞模型,Bo NT/A HC的作用表现为低浓度(0.1 nmol/L)的促进作用而高浓度(10 nmol/L)时呈现抑制。     

谈谈美国的转基因玉米

正美国所有的玉米食品(除了甜玉米外,下同)都含有转基因成分,因为法律规定10%的非转基因玉米必须与转基因玉米混种,其结果就是非转基因玉米与转基因玉米混种,混收,混加工,混出口。所谓的BT"毒蛋白"在美国已经不归为农药范畴,没有残留量指标,任何食品和饮用水中的BT蛋白含量已无需监测,不仅不是毒蛋白,而且属于食品蛋白     

用快速蛋白液相色谱法(FPLC)精制肉毒毒素

<正> 在液体培养基中,肉毒梭菌神经毒素(NT)蛋白与非神经毒素蛋白紧密结合。在神经毒素精制中,分几步来精制这种稳定的复合物。人们早已熟知的结晶肉毒毒素就是该复合物,含有约20％(w/w)神经毒素。1965年到1970年间,我们相继用色谱精制法收获了>90％纯度的神经毒素。为了提高纯度,减少流速,洗脱,梯度斜率的变动性,并且得到我们已经使用的快速蛋白液相色谱法更具重复性的结果,对神经毒素的三种血清型进行了检查,将A、B、E型复合物交连在Momo Q柱上, pH值为7.5-8.0,0.02m(摩尔) Tris-HC1或 0.05M Tris-HC1缓冲液。将已交连的A、B和E型神经毒素用0.12,0.13,0.08MC1-线性梯度洗     

外源性蛋白酶对肉毒毒素的作用初探

将B型肉毒毒素在毒素粗提阶段用胰蛋白酶处理,再经浓缩、柱层析和结晶得到纯化的B型肉毒毒素复合物。结果表明:B型肉毒神经毒素经胰蛋白酶处理后单链裂解为双链,在非还原条件下SDS-PAGE显示神经毒素条带,在还原条件下SDS-PAGE只显示轻(L)、重(H)二链条带,而不显示神经毒素条带;纯化后毒素复合物的比活性提高了5.9倍,达到1.60×108LD50/mgPr;HPLC显示活性成分峰面积所占比例增加了9.83%。     

瘟病毒的p80(NS3)蛋白

p8 0蛋白为瘟病毒一种多功能的非结构蛋白。综述了p80蛋白的丝氨酸蛋白酶 ,NT Pase酶及RNA解旋酶 3种酶活性 ,并进一步探讨了p80蛋白在瘟病毒生命周期和致性方面的重要性。     

相思豆毒蛋白的提取及毒理作用研究

目的:探索相思豆毒蛋白的最佳提取条件、蛋白含量、等电点及对动物的毒理作用. 方法:经pH 7.2磷酸缓冲液提取、浓度为30%、50%硫酸铵分级沉淀及甘油透析处理,从去壳相 思豆种子中提取得到相思豆毒蛋白,福林酚法测定蛋白含量,等电聚焦法测定相思豆毒蛋白等电点,小白鼠和家兔灌胃实验研究其毒理作用.结果:从去壳相思豆中 分离提取得到相思豆毒蛋白;相思豆毒蛋白的等电点为6.10和6.24.动物实验表明该毒蛋白对小白鼠、家兔具 有毒性.结论:磷酸缓冲液法是相思豆毒蛋白适宜的提取途径,相思豆毒蛋白对动物具有毒性.     

肉毒杆菌毒素的作用机理(上)

前言肉毒杆菌毒素(Botulinum toxin,以下简称肉毒)是梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)在厌氧环境生长过程中产生的毒素,其化学本质为一大分子量的蛋白质。依其抗原性,现已分离出七种(A、B、C_α、C_β、D、E、F、G)不同的免疫类型,引起人类中毒的主要是A、B、E型。肉毒中毒虽非常见多发病,但死亡率很高,且常暴发形式发生。有关肉毒中毒的临床及实验研究已有不少专著与综述。肉毒是迄今为止人们所知道的最毒物质,A型肉毒结晶(为平均长短径85微米与5微米的杆状)一微克即可杀死体重20克的小白鼠20万只,Van Heyningen(1950)推算对一个成人的致死量只有万万分之七克!曾有报道,基于     

肉毒杆菌毒素的作用机理(下)

作用特点剂量-反应曲线引起机体中毒或阻遏离体神经-肌肉标本接头传递所需要的肉毒绝对量是很少的,曾有人以每只豚鼠与小白鼠含有250万个神经细胞推算,它们分别平均每个神经细胞只要4或8个肉毒分子便可被杀死。将稀释几个数量级的肉毒溶液注射给动物,动物存活时间仅较注射未经稀释原液的延长几分钟。肉毒作用的剂量-反应关系为双对数曲线,即将毒素剂量、反应大小分别取对数,二者关系呈一直线。将哺乳动物膈神经-膈肌