高效特异的抗日本血吸虫循环抗原免疫血清制备的研究

制备高效特异的抗血吸虫循环抗原的免疫血清,是提高检测循环抗原方法灵敏度的重要环节。Bawden(1974)曾用淀粉凝胶电泳分离循环抗原,用甲基化牛血清白蛋白作为载体致敏动物,但所得的抗血清特异性较差。平田瑞成(1976)用酚抽提循环抗原制备抗血清,但免疫源性较差。Deelder(1976)     

日本血吸虫Sj Cyclophilin B基因的克隆、表达及免疫保护效果分析

本研究克隆和表达了日本血吸虫Cyclophilin B(Sj CyPB)编码基因的cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。本研究以日本血吸虫童虫cDNA为模板,RT-PCR扩增其基因全长cDNA,提交序列到NCBI,登录号为GQ403665。荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,构建重组表达质粒,表达纯化重组蛋白。利用Western blotting检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。结果表明,RT-PCR获得了Sj CyPB编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为672bp。经分析确定其为CyPs家族中的CyPB基因,命名为Sj CyPB。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在18d童虫期表达量最高,32d次之。构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-SjCyPB,并在大肠杆菌中成功表达,表达产物分子量为49.5kDa。Western blotting试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得31.5%的减虫率和41.01%的肝脏减卵率。本研究获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPB基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPB原核重组表达质粒,并在大肠杆菌中成功表达,证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。     

肠道沙门氏菌O-抗原多糖的研究进展

O-抗原是由多糖重复单元组成的多聚糖,表达于细菌的外膜,具有多样性,是划分沙门菌血清型的重要依据。O-抗原多糖由多基因协同作用而合成,这些基因在沙门菌基因组上成簇存在,形成O-抗原基因簇。O-抗原多糖也是重要的毒力因子,在沙门菌入侵宿主、体内存活、定殖等致病过程中均发挥着重要的作用。此外,O-抗原还是沙门菌主要的保护性抗原,能激发宿主产生高水平抗体并发挥免疫保护作用,成为疫苗研究的靶点。本文综述O-抗原多糖的基因结构和合成、生物学功能及其在疫苗研制中的应用与前景。     

单性感染及复性感染日本血吸虫发育的研究

1.单性感染之雌性日本血吸虫平均不超过5.35±0.07毫米,只为复性感染中成熟雌虫长度之1/3左右,且其生殖器官始终呈童雏状态。单性感染之雄虫能发育成熟,贮精囊内也有活动精子,但其大小与成熟合抱之雄虫平均相差3.05毫米左右。 2.宿主性别之不同对于血液中的雄性血吸虫有比较显著的影晌。在雄性宿主体内单性雄虫比雌性宿主体内之单性雄虫发育快。宿主性别之不同对于单性雌虫之影响则不甚明显,雌性宿主体内发育之雌虫仅略大于在雄性宿主体内之单性雌虫。 3.血液中合抱成熟之雌虫及雄虫的分泌物质不能促使未合抱之雄虫发育正常。未合抱之雄虫似略大于单性感染之雄虫,但是显著小于合抱雄虫。 4.合抱成熟之雌虫及雄虫的分泌物质对于未合抱之雌虫完全没有促使发育的作用。相反地,有一定的抑制作用而使未合抱之雌虫显著地小于单性感染之雌虫,二者之生殖器官皆停留于雏形状态。 5.复性感染中每对雌雄成虫之抱合是永久性的。每一条雄虫只能促使一条雌虫发育成熟而不再转换抱合其余未成熟之雌虫。 6.鉴于雌雄合抱对于日本血吸虫正常发育的必要性,故就生物进化之观点讨论了日本血吸虫雌雄异体的原始性。     

日本血吸虫童虫在终末宿主体内迁移途径的研究

日本血吸虫尾蚴侵入终末宿主体内后,童虫期的迁移途径曾经若干学者的考察,如宫川米次(1912,1913,1916),楢林兵三郎(1914,1916),Miyagawa and Takemoto(1921)Faust and Meleney(924),Sadun,Lin and Williams(1958)等。研究曼氏血吸虫的迁移途径的有 Faust,Jones and Hoffman(1934)。在经肤感染发现后,在本世纪十至二十年代     

日本血吸虫虫卵、童虫和雌雄成虫膜蛋白的双向电泳

血吸虫寄生生活复杂,中间宿主和终末宿主转换,有性繁殖和无性繁殖交替,由其感染引起的血吸虫病仍严重危害人畜健康(陈贤义等,2002).研究表明,血吸虫不仅能利用宿主的免疫信号分子伪装自己获得宿主的免疫兼容(Salzet et al.,2000),而且还在血吸虫中克隆到宿主信号分子的受体(Ahmed et al.,2001).     

吡喹酮对日本血吸虫的皮层、合体细胞、卵黄细胞和肌纤维的超微结构的影响

近年来的研究结果表明,血吸虫的皮层不仅吸附宿主的抗原,借以产生“伴随免疫”,使其不受宿主的免疫攻击而得以生存(Smithers等,1969;Smithers和Terry,1976;Goldring等,1977);同时,许多营养物质如葡萄糖、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱等亦主要是从皮层摄人的(Fripp,1967;Chappel,1974;Asch等,1975;Levy和Read,1975;Rogers和Bueding,1975),故血吸虫的皮层不仅具有防御的功能,而且在其生理活动过程中亦具有     

日本血吸虫三价DNA疫苗pVIVO2 SjFABP/Sj26.SjGAPDH的构建及其免疫保护作用评价

目的:构建含有日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(SjFABP),3-磷酸甘油醛脱氢酶(SjGAPDH),26kDa谷胱甘肽S转移酶(Sj26)的三价DNA疫苗,并通过药理实验评价其抗血吸虫感染的免疫保护作用。 方法:  以血吸虫成虫RNA为模板制备cDNA第一链,RT-PCR扩增得到抗原基因片段,再通过重组PCR技术,将Sj26和SjGAPDH融合为Sj26.SjGAPDH基因。将SjFABP和Sj26.SjGAPDH分别克隆入pVIVO2的mcs1和mcs2,获得重组质粒pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH。瞬时转染MCF-7细胞,通过逆转录PCR（RT-PCR）检测抗原基因在mRNA水平的表达,通过间接荧光免疫（IIF）检测抗原基因在小鼠体内抗原水平表达,验证了DNA疫苗的有效性;并免疫小鼠后进行免疫保护性初步试验。结果:  经过酶切、测序及体内外表达验证,该三价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH构建成功;该三价DNA疫苗在小鼠抗血吸虫感染中诱发减虫率和减卵率达到58.6%和59.8%。结论:  该三价DNA疫苗组具有比单价和双价DNA疫苗组更加良好的免疫保护作用,为日本血吸虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

基于髓源性抑制细胞的食药用菌多糖抗肿瘤免疫作用机制

髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是一种异质性的免疫调节细胞。在癌症机体中,MDSCs是主要的免疫抑制细胞,通过多种途径诱导T淋巴细胞衰竭和凋亡,促进肿瘤细胞逃逸,从而导致肿瘤不受控制地生长,是癌症治疗的主要障碍。目前,MDSCs是癌症药物研究的热点和关键靶点。近年来,研究报道显示多糖可下调MDSCs在癌症患者及肿瘤实验动物体内数量和比例,并诱导免疫抑制功能丧失。食药用菌多糖是天然多糖的主要来源,可以通过多种途径激活肿瘤免疫应答,其抑制MDSCs功能的研究报道逐年增多,目前研究主要集中在香菇多糖、灵芝多糖等部分种类。因此,本文简要描述髓源性抑制细胞在癌症中的免疫抑制功能,然后详细地综述食药用菌多糖对髓源性抑制细胞作用的研究进展,以期为食药用菌多糖在肿瘤免疫药物开发及辅助增强(如免疫检查点抑制剂)等免疫治疗提供新思路。     

单克隆抗体抑制性酶联免疫吸附试验：（I—ELISA）检测日本血吸虫虫卵抗原

检测血吸虫抗原较之检测虫体的明显优点是可准确地估计虫荷以及判断是否活动性感染,有助于了解化疗效果。近年来国内已有用双抗体夹心酶联法检测血吸虫循环抗原的报道。使用高效特异的单克隆抗体可望进一步提高检测的敏感性。本文对单克隆抗体(McAb)I-ELISA检测日本血吸虫虫卵抗原的敏感性和特异性作了初步探讨。有关本法检测感染日本血吸虫的动物和病人血中血吸虫虫卵抗原的情况将另文报道。材料与方法McAb制备:用日本血吸虫虫卵抗原(SEA)免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与SP2/O小鼠骨髓瘤细胞融合,经克隆化后获得3株分泌抗日本血吸虫…     

日本血吸虫发育的组织化学研究

本文报告了日本血吸虫在小鼠体内发育过程中虫体内组织化学的定位及其所发生的改变。组织化学的研完结果表明日本血吸虫在小鼠体内生长和发育过程中童虫体内物质呈现动态的改变,主要表现为: 1.在皮肤中的早期童虫仅在体后端实质组织内含有丰富的硷性磷酸酶活力,随着虫体的移行和生长,实质组织的阳性反应减弱或消失,而在体壁出现了极强的酶活力 2.刚侵入皮肤的童虫体内贮有大量糖原,随着虫体的移行和发育,糖原显著减少,至将成熟时又再贮存糖原,且于成熟后一直保持着丰富的含量。 3.未在发育阶段的童虫体内查见脂类物质,仅在性将成熟及充分成熟的雄虫实质组织和雌虫卵黄细胞中才沉积相当量的脂类。 4.在发育过程中,两性生殖腺无明显的多糖物质,但一直含有丰富的核酸和蛋白质,至雌虫将成熟时又在卵黄细胞中出现了制造卵壳的前身物,蛋白质、酚及酚酶。 最后,对血吸虫的发育生理学进行了讨论。     

人源札幌病毒抗原多样性及遗传进化研究进展

人源札幌病毒(human sapovirus, HuSaV)是全球范围内引起散发性急性胃肠炎和相关疫情的重要病原,尤其对婴幼儿及免疫缺陷患者等高危人群存有致死的危险,人源札幌病毒具有丰富的抗原和遗传多样性,其抗原多样性及免疫原性主要位于P2亚结构域,并且衣壳蛋白免疫原性是人源札幌病毒疫苗研发的理论基础。由于人源札幌病毒可以耐受高衣壳突变而不失去病毒功能使它得以迅速进化,其在宿主体内进化过程中存在连续的氨基酸突变,且突变主要在VP1的P结构域内积累,少见于非结构蛋白和VP2中。序列和结构的改变使得人源札幌病毒逃脱先前存在的群体免疫,有必要进一步探索人源札幌病毒的免疫逃逸机制及其拮抗宿主的免疫应答。因此,本文针对人源札幌病毒在基因组特征、抗原多样性特点、遗传进化机制等领域的研究进展进行了系统综述,并对未来研究中亟待解决的科学问题进行了展望。     

核酸疫苗初免-蛋白疫苗加强的免疫策略提高日本血吸虫核酸疫苗免疫效果

为研制抗血吸虫疫苗提供实验依据,探讨了抗血吸虫SjGST-32核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫的免疫增强效应及免疫应答特征。将日本血吸虫DNA疫苗VR1012-SjGST-32与重组蛋白疫苗rSjGST-32分别在第0、2和4周免疫小鼠,在第6周攻击感染日本血吸虫尾蚴,攻击感染45 d后剖杀小鼠,计算减虫率、检卵率以及检测肝脏病理变化,观察免疫保护效果;检测小鼠血清中特异性IgG抗体滴度,T细胞增殖反应和抗原特异性CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+和CD4+IL-10+的数量,探讨免疫应答特征。结果显示,DNA初免-蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独免疫组,显著提高了减虫率(42.3%)和减卵率(59.6%),并且能够显著减轻血吸虫虫卵对肝脏的病理损害;进一步发现,DNA疫苗和蛋白疫苗联合应用增强了机体T淋巴细胞增殖反应、抗体IgG滴度以及抗原特异性CD4+IFN-γ+的产生。这些研究为新型血吸虫疫苗的优化设计和合理应用提供了依据。     

068重组葡萄球菌株诱生白喉抗毒素

以非致病性菌株表达目的抗原,可望诱导有效的免疫应答,其中以革兰阳性的木糖葡萄球菌、肉质葡萄球菌尤为安全、高效.它们与金黄色葡萄球菌有低水平的DNA同源性,但却不产生有致病力的毒素、溶血素、凝集素、蛋白A等,可作为抗原的活载体,有效表达全部或部分抗原成分,诱导持久的体液免疫反应.本实验旨在研究毒性蛋白上某一定义完整的结构域能否被表达在这两种菌株表面,它们能否在小鼠体内诱生中和抗体.已知,白喉毒素(DT)的382～535氨基酸片段是结构完整的区域,为受体结合域DTR.     

凸形假单胞菌对钉螺的杀灭作用

日本血吸虫病是流行在我国南方一些省(市)的一种严重疾病。从1966年开始,我们开展利用微生物杀灭日本血吸虫的中间宿主钉螺的研究。1967年从活田螺体内分离出一株Thp1菌株,1971年又从自然死亡率高达48%     

日本血吸虫尾蚴钻穿宿主皮肤的方式

本文报道了日本血吸虫尾蚴钻穿宿主皮肤的全过程和早期童虫在8种动物皮肤中动态分布的结果。阐明了血吸虫尾蚴钻穿宿主皮肤是依靠其体内头腺及/或钻腺分泌物的酶促作用、头器伸缩的探查作用及全身肌肉运动的机械作用而协同完成的。指出了尾蚴入侵皮肤界面和童虫在皮肤内移行常以倾斜角度前进,并非完全呈垂直方向或沿毛囊皮脂腺的通道。观察到童虫钻破皮肤血管壁进入血管腔的情景,这有力地提供了血吸虫童虫从皮肤进入血液循环系统的直接证据。     

噬菌体展示日本血吸虫SSj14单抗的模拟抗原表位及其免疫保护性研究

为获得日本血吸虫保护性单抗SSj14的模拟抗原表位,研究其对日本血吸虫的免疫保护作用。用纯化的SSj14单抗筛选噬菌体随机12肽库,对33个克隆进行ELISA验证,获得30个阳性克隆,DNA序列分析表明这30个克隆分属11个多肽序列,分析比较发现这些多肽具有“H_NQ_X_S_PF_X_X_L_A_T”的相似基序。进而选取3个阳性单克隆及混合阳性噬菌体克隆进行Western_blotting实验,证明都有良好的抗原性。用它们免疫BALBc鼠,并攻击血吸虫尾蚴,观察免疫鼠抗血吸虫感染的保护效果和IL_12的变化,结果表明:筛选获得的噬菌体阳性克隆具有良好的免疫原性,能诱导免疫鼠产生高滴度的抗血吸虫的特异性抗体;和对照组鼠相比,免疫小鼠,分别获得13.84%～52.83%的减虫率,34.17%～65.47%的肝脏减卵率以及28.89%～73.78%的粪便减卵率;三次免疫之后,和对照组相比,免疫小鼠体内IL_12水平均有升高。为发展日本血吸虫疫苗提供了新思路、新途径。     

小眼虫的核骨架研究

小眼虫细胞经轻度超声处理、选择性抽提后,利用DGD包埋-去包埋剂电镜技术及Westernblot分析技术对其核骨架、核纤层进行了研究.结果显示;细胞核内存在一个不被DNase所降解和热三氯醋酸所去除的纤维蛋白性网架结构;核的周围有一层明显的核纤层结构;Westernblot分析表明其核纤层有两种阳性蛋白成分,一为相当于高等真核细胞核纤层蛋白laminB的强阳性成分,另一为相当于laminA的弱阳性成分,但无相当于laminC的成分.本文认为小眼虫这种低等的单细胞真核生物已具有了核骨架、核纤层结构,其核纤层的蛋白组成应该代表了核纤层进化历程中早期的一个阶段.       

体内诱导抗原技术筛选病原菌体内诱导抗原的研究进展

体内诱导基因是病原菌在宿主体内能够表达而体外培养时却不能表达的功能基因,其对病原体在宿主体内的生存和致病具有重要意义。体内诱导抗原技术(in vivo induced antigen technology, IVIAT)已广泛应用于筛选病原体体内诱导基因,相较于其他用于筛选体内诱导基因的技术,IVIAT具有无需动物模型、检测病原菌在不同感染阶段产生的抗原等独特优势。IVIAT鉴定出的体内诱导抗原对病原体在宿主中的毒力、代谢及存活具有重要意义。现就IVIAT的原理、IVIAT筛选出的人类疾病相关病原菌的体内诱导抗原及其功能研究等作一概述。     

日本血吸虫SjOST48基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫保护效果分析

为了鉴定日本血吸虫SJCHGC01743基因并评估其重组蛋白作为新的血吸虫病候选疫苗抗原的潜力,利用PCR技术扩增日本血吸虫SJCHGC01743基因,应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的转录水平,以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并诱导其在大肠杆菌中表达。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,利用Western blotting检测重组蛋白的免疫原性,应用间接免疫荧光技术对SJCHGC01743进行蛋白组织定位,利用间接ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体水平。将重组抗原免疫小鼠,评估其免疫保护效果。PCR扩增得到1 248 bp不含信号肽的c DNA序列,同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫寡糖转移酶OST48亚基,命名为Sj OST48。实时定量PCR分析显示Sj OST48在检测的童虫和成虫各个期别虫体中均有转录,其中在28 d虫体中的转录水平最高,在42 d雌虫中的转录量显著高于雄虫。构建的重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj OST48成功在大肠杆菌中表达,重组蛋白r Sj OST48分子量约50 k Da。Western blotting分析表明r Sj OST48能被小鼠免疫血清识别,具有良好的免疫原性,间接免疫荧光实验表明Sj OST48蛋白主要分布于虫体体被,少量分布于实质。ELISA检测结果表明r Sj OST48能诱导产生较高的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体。动物免疫保护实验结果表明Sj OST48能诱导小鼠产生32.62%(P0.05)的减虫率及57.61%(P0.01)的肝脏减卵率。本研究为深入探讨日本血吸虫Sj OST48基因的生物学功能及筛选新的血吸虫疫苗候选分子奠定了基础。