单碱基编辑系统介导欧拉藏绵羊GDF9、FecB多胎基因的定点突变

本研究旨在利用单碱基编辑系统(single base editing system)实现欧拉藏绵羊成纤维细胞FecB和GDF9基因靶位点A到G和C到T的碱基替换并检测其编辑效率。首先设计合成靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA序列,再分别连接至epi-ABEmax、epi-BE4max质粒,构建载体并电转至欧拉藏绵羊成纤维细胞,最后对阳性细胞FecB和GDF9基因进行Sanger测序鉴定靶位点突变结果,并通过T-A克隆估算单碱基编辑系统的编辑效率。结果显示获得了靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA,并构建使欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因单碱基突变的载体,FecB基因靶位点编辑效率为39.13%,GDF9基因靶位点(G260、G721、G1184)编辑效率分别为10.52%、26.67%和8.00%。本研究运用单碱基编辑系统在欧拉藏绵羊成纤维细胞上实现了FecB和GDF9基因靶位点突变,为改良欧拉藏绵羊一胎多羔的繁殖性状奠定理论基础。     

等Tm检测探针寡核苷酸芯片在p53突变热点检测中的应用

用等长探针检测基因的点突变,不同GC含量探针的碱基错分辨率很难均一。尝试利用探针近似等Tm的原则设计、制备了检测抑癌基因p53外显子7中密码子245、248、249单碱基突变及缺失的寡核苷酸芯片。实验得到较好的碱基错配分辨率,检测不同位点的碱基错配分辨率较为一致,芯片检测结果与测序结果一致。实验结果为制备检测p53常见热点突变的寡核酸芯片奠定了基础。     

寡核苷酸芯片技术用于检测过氧化物酶体活化物激活受体基因多态性

 通过寡核苷酸芯片技术检测PPARα基因Leu162Val、Val227Ala多态性和PPARγ Pro12Ala的基因多态性,建立一种快速、简便、准确的方法,为研究非酒精性脂肪性肝病的发病机制、临床诊断和治疗提供依据.收集人体外周血标本,提取DNA进行PCR扩增,设计相应的探针和引物,制备检测芯片,PCR产物与芯片杂交后,扫描芯片并分析结果.PCR产物进行测序验证.寡核苷酸芯片技术检测PPARα基因Leu162Val、Val227Ala多态性和PPARγ Pro12Ala基因多态性结果与测序结果一致.寡核苷酸芯片技术检测非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)密切相关的PPAR基因多态性快速、准确,值得临床推广和应用.     

四引物扩增受阻突变体系PCR快速测定绵羊 BMPR-IB基因型方法的建立

四引物ARMS PCR是检测SNP有效、快速、简便的方法.绵羊BMPR-lB基因是控制Booroola绵羊多胎性状的主效基因,此研究目的在于建立一种对BMPR-IB基因四引物ARMS PCR检测方法.根据四引物ARMS PCR技术原理,在绵羊BMPR-IB基因突变位点(A746G)设计一对特异性引物,并在突变点两侧设计一对参照引物,用来扩增含有突变点的DNA片段,可在一步PCR反应中根据电泳图谱准确判断绵羊个体的BMPR-IB基因型,对比PCR-RFLP检测结果表明,所建立的方法简单,操作简便,大大提高了检测效率.     

绵羊微卫星BMS2508和FecB基因的多态及连锁分析

文章分析与绵羊高繁殖力主效基因FecB紧密连锁的微卫星座位BMS2508在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊)和低繁殖力绵羊品种(特克塞尔、多赛特和中国美利奴)中的遗传多态性, 同时探讨该微卫星座位与小尾寒羊FecB基因的连锁不平衡关系。高繁殖力品种小尾寒羊在骨形态发生蛋白受体IB(Bone morphogenetic protein receptor IB, BMPR-IB)基因编码序列第746位碱基处发生了与Booroola Merino绵羊相同的FecB突变(A746G), 而在低繁殖力的特克塞尔、多赛特和中国美利奴绵羊中没有检测到该突变; 小尾寒羊BB、B+、++的基因型频率分别为0.485、0.398和0.117。微卫星座位BMS2508在4个绵羊品种的438个个体中共检测到8个等位基因和15种基因型, 最小等位基因为94 bp, 最大等位基因为116 bp; 小尾寒羊(n = 307)、特克塞尔(n = 45)、多赛特(n = 46)、中国美利奴(n = 40)和BB型(n = 149)、B+型(n = 122)、++型(n = 36)小尾寒羊群体中优势等位基因分别是100 bp、94 bp、94 bp、112 bp、100 bp、100 bp、112 bp, 其频率分别为0.453、0.544、0.802、0.475、0.483、0.439、0.389。连锁不平衡分析显示小尾寒羊FecB基因B等位基因与BMS2508微卫星座位100 bp等位基因之间存在一定的连锁不平衡(D′=0.408), 而+等位基因与BMS2508微卫星座位110 bp和114b p等位基因均存在一定的连锁不平衡(D′=0.513)。     

MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点检测集成芯片的建立

摘要: 文中建立了一种新型的寡核苷酸芯片, 用于线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(Mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes, MELAS)和肌阵挛性癫痫伴发不规整红纤维(Myoclonic epilepsy with ragged red fibers, MERRF)线粒体DNA所有已知突变位点的集成检测。将31对allele位点特异性的寡核苷酸探针包被在醛基修饰的载玻片表面, 以多重不对称PCR方法制备Cy5荧光标记靶基因。利用此芯片对5例MELAS患者、5例MERRF患者及20例健康对照进行筛查, 结果发现, MELAS患者均为MT-T1基因A3243G突变; 在MERRF患者组, MT-TK基因A8344G突变4例, T8356C突变1例; 健康对照组均未发现31种相关mtDNA突变。芯片检测与DNA测序结果完全一致。结果表明, 这种寡核苷酸芯片可以对MELAS和MERRF综合征已知突变位点进行同步快速检测, 具有较高的灵敏度和特异性。这一模式的基因芯片经过适当改装后也可用于其他人类线粒体疾病的基因诊断。     

基因芯片技术筛选家蝇抗菌肽相关基因

用生物学软件对GenBank中部分昆虫抗菌肽基因编码区保守域设计探针, 用直接点样法将探针点印在特制玻片上构建寡核苷酸(Oligonucleotide, oligo)探针微阵列; 提取诱导后24 h的家蝇三龄幼虫脂肪体总RNA, 逆转录成cDNA并标记上荧光标记物Cy3, 与构建的oligo探针微阵列杂交, 经洗片、扫描处理后进行数据分析。结果在两次重复实验中均检测到有效杂交信号的基因点有15个(不包括阳性对照基因), 为进一步发现其新基因提供了依据。     

HBV耐药相关DNA突变体的构建及在寡核苷酸基因芯片分析中的应用

拉米呋啶（Lamivudine)是近年来开发成功的一种治疗HBV慢性感染病人的核苷类药物。随着拉米呋啶在临床上广泛使用,HBV耐药现象已成为临床实践中的棘手问题。建立HBV耐药测定技术成为HBV基础研究和临床实践中企待解决的一个重要问题。寡核苷酸芯片（Oligochip)是近年来发展并逐步成熟的一种高通量基因检测技术,已成功应用于基因突变快速和高通量检测。本研究在构建HBV拉米呋啶抗性相关HBV多聚酶基因突变体基础上,设计并制备了HBV耐药寡核苷酸芯片（HBV－Lam Oligochip)。根据HBV拉米呋啶抗药性相关突变主要位于HBV多聚酶基因的L526、A546、M550和V553等氨基酸位点,设计了28条寡核苷酸探针。探针对应序列为HBV DNA聚合酶基因反义链,HBVHBVhb长度为15－18nt。探针合成时在其3′端接氨基和间隔臂（spacer)等特定修饰;探针纯化与定量后,用基因芯片点样仪点到醛基修饰载玻片上,制成HBV耐药寡核苷酸芯片（HBV－Lam Oligochip)。为了分析基因芯片的性能,克隆了833号HBV病人血清中HBV DNA聚合酶基因,测序证实为HBV DNA野生型（即未发生突变）。以该DNA为模板,用PCR法构建了HBV耐药相关突变体。用HBV－Lam Oligochip对HBV野生型DNA和人工构建DNA突变体进行了检测。结果发现,HBV－Lam Oligochip能有效检测出野生型DNA序列。检测突变体时,HBV－Lam Oligochip检测结果与相应突变体DNA序列一致,表明HBV－Lam Oligochip不仅可检测出野生型序列,而且可有效地分辨出单碱基突变,可应用于HBV耐药基因突变临床检测。     

三色荧光技术在SNP检测中的应用

利用三色荧光标记的A、C、T双脱氧核苷酸单碱基延伸的方法结合编码寡核苷酸芯片技术检测单核苷酸多态性 (SNP)的基因型。以beta地中海贫血样本基因 (HBB基因 )突变作为模型的研究结果显示该方法能同时对多位点的SNP进行检测。     

绵羊FecB突变对BMPR1B活性及BMP/SMAD通路的影响研究进展

BMPR1B是绵羊中被鉴定的第一个多羔主效基因,但该基因中FecB突变增加绵羊排卵数的分子机制尚未解析。近年来发现BMPR1B活性受小分子抑制蛋白FKBP1A调控,该蛋白充当了BMPR1B及BMP/SMAD通路活性控制开关的关键作用且FecB突变恰好位于FKBP1A与BMPR1B结合位点附近。本文首先总结了BMPR1B和FKBP1A的蛋白结构,阐明二者空间结合区域及FecB突变的位置,进而预测了FecB突变与二者结合强弱的关系,最终提出了FecB突变通过影响BMPR1B与FKBP1A结合强度改变BMP/SMAD通路活性的科学假设,为后续探明FecB突变影响绵羊排卵数的分子机制提供了新思路。     

BMPR-IB和BMP15基因作为小尾寒羊多胎性能候选基因的研究

以控制BooroolaMerino羊多胎性能的BMPR IB基因 ,以及影响Invedale和Hanna羊排卵数的BMP15基因作为候选基因 ,从分子水平上对小尾寒羊的多胎机制进行研究 ,分析突变位点的特性 ,并通过大规模的群体检测统计推断其遗传效应。实验结果表明 :多胎品种小尾寒羊在BMPR IB基因的相应位置上发生了与BooroolaMerino羊相同的突变 (A74 6G) ,该基因的BB基因型在小尾寒羊群体内为优势基因型 ,且小尾寒羊初产和经产母羊的BB基因型比 ++基因型分别多产 0 97羔 (P <0 0 5 )和 1 5羔 (P <0 0 1) ,推测BMPR IB基因与控制小尾寒羊多胎性能的主效基因存在紧密的遗传连锁。而BMP15基因在小尾寒羊中不存在V31D或Q2 3Ter突变 ,说明小尾寒羊的多胎遗传机制与Romney羊不同 ,因此排除了BMP15突变影响小尾寒羊排卵数的可能性。     

绵羊产羔性状主效基因检测研究

以绵羊BMP15基因和BMPR-IB基因为候选基因,以湖羊、中国美利奴单胎品系、中国美利奴肉用和毛用多胎品系为研究对象,采用PCR-RFLP方法对候选基因进行单核苷酸多态性（SNP）位点检测和基因型分析,同时研究基因对绵羊产羔数的影响。对BMP15基因进行SNP检测,结果未发现多态性位点;对BMPR-IB基因进行多态性检测,结果发现了一个A746 G SNP位点。依据A746 G SNP位点进行基因型分析,结果在各品种（系）羊中发现了3种基因型,即BB、B+和++。等位基因型频率在各品种（系）间差异极显著（P<0.001）,在湖羊中以BB基因型为主,在中国美利奴单胎品系中以++基因型为主, 而在中国美利奴肉用和毛用多胎品系中以B+基因型为主。BMPR-IB A746G位点的变异明显影响绵羊的产羔数,与++基因型母羊相比, BB和B+基因型母羊产羔数明显较多。研究结果同时表明,利用BMPR-IB基因型可以很好的预测母羊的产羔数。研究获得的这些结果强烈表明BMPR-IB为影响绵羊的产羔数的主效基因,可以用于对绵羊产羔数的选择。Abstract: The current study was designed to detect SNPs within BMP15 and BMPR-IB gene and investigate the effect of the genes on sheep litter size. Four sheep lines, HU-Yang, Chinese M erino monotocous, Chinese Merino multiparous for wool production and Chinese Merino multiparous for mutton production, were used in this study. Litter sizes were recorded for each ewe in the four lines. Primers for BMP15 and BMPR-IB gene were designed from database sheep sequence and polymorphisms were detected by PCR-RFLP method. The results showed that there was no polymorphism with BMP15 gene among the four lines, and there was an A / G SNP with BMPR-IB gene at base 746 among the four lines. Three types of genotype (BB, B+ and ++), based on A / G locus, were found within each line. The frequencies of genotypes were significantly different among the lines (P<0.001), with BB genotype primarily existing in HU-Yang, ++ genotype in Chinese Merino monotocous line, and B+ genotype in Chinnese Merino multiparous lines. The A / G mutation influence significantly the sheep litter sizes, and the BB and B+ ewes had significant higher litter sizes than ++ ewes. The results of present study showed simultaneously that the genotype of BMPR-IB was a perfect predictor of the sheep litter sizes. These results intensively indicated that BMPR-IB is a major gene to affect litter size in sheep, and could be used as the molecular genetic marker to select litter size in sheep.     

优良的BMPR-IB基因型可提高绵羊冷冻胚胎的受胎效果

以控制BooroolaMerino羊高繁殖力的BMPR-IB基因为候选基因,以小尾寒羊及其杂交羊、东北半细毛羊、澳洲美利奴羊、德国肉用美利奴羊、萨福克羊、特克塞尔羊、夏洛莱羊为试验对象,采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行基因单核苷酸多态性(SNP)检测和基因型分析,同时研究基因对高繁殖力的影响.研究结果表明:小尾寒羊及其杂交羊、东北半细毛羊和夏洛莱羊群体中发现了与BooroolaMerino羊相同的A746G碱基突变,而小尾寒羊及其杂交羊群体的B等位基因频率明显高于其他2个品种.另外4个品种中未发现此突变.携带B等位基因的群体较非携带B等位基因群体排出更多的卵子,排卵后黄体直径较小.移植入冷冻胚胎后, 、B 和BB3种基因型群体的妊娠率分别为38.78%、45.71%和66.67%.由此推断,BMPR-IB基因突变很有可能从增加卵巢排卵数和提高胚胎着床及妊娠建立效率两个方面同时影响绵羊高繁殖力性状.所得BB型群体冻胚移植妊娠率明显高于 和B 型群体,已接近鲜胚移植水平,通过PCR-RFLP方法进行基因型分析,选用合适基因型群体作为胚胎移植受体,有可能为提高绵羊胚胎移植受胎率提供新的方向.     

Association of the widespread A149P hereditary fructose intolerance mutation with newly identified sequence polymorphisms in the aldolase B gene.

Hereditary fructose intolerance (HFI) is a potentially fatal autosomal recessive disease resulting from the catalytic deficiency of fructose 1-phosphate aldolase (aldolase B) in fructose-metabolizing tissues. The A149P mutation in exon 5 of the aldolase B gene, located on chromosome 9q21.3-q22.2, is widespread and the most common HFI mutation, accounting for 57% of HFI chromosomes. The possible origin of this mutation was studied by linkage to polymorphisms within the aldolase B gene. DNA fragments of the aldolase B gene containing the polymorphic marker loci from HFI patients homozygous for the A149P allele were amplified by PCR. Absolute linkage to a common PvuII RFLP allele was observed in 10 A149P homozygotes. In a more informative study, highly heterozygous polymorphisms were detected by direct sequence determination of a PCR-amplified aldolase B gene fragment. Two two-allele, single-base-pair polymorphisms, themselves in absolute linkage disequilibrium, in intron 8 (C at nucleotide 84 and A at nucleotide 105, or T at 84 and G at 105) of the aldolase B gene were identified. Mendelian segregation of these polymorphisms was confirmed in three families. Allele-specific oligonucleotide (ASO) hybridizations with probes for both sequence polymorphisms showed that 47% of 32 unrelated individuals were heterozygous at these loci; the calculated PIC value was .37. Finally, ASO hybridizations of PCR-amplified DNA from 15 HFI patients homozygous for the A149P allele with probes for these sequence polymorphisms revealed absolute linkage disequilibrium between the A149P mutation and the 84T/105G allele. These results are consistent with a single origin of the A149P allele and subsequent spread by genetic drift.     

DNA芯片与应用

DNA芯片就是利用光导原位化学合成或液相合成自动化点样,将数以万计的寡核苷酸固定于固相支持物硅片、尼龙膜上,与荧光素或同位素标记的特检样本DNA/cDNA杂交,通过对杂交信号分析反映样本中的DNA序列信息。它广泛应用基因表达、DNA测序、基因分型、基因突变与多态性检测和遗传作图等生物医学研究领域。     

小鼠细胞因子相关基因表达检测寡核苷酸芯片的制备及分析

生物芯片技术用于基因表达谱研究是近年来发展起来的一项新技术 ,该方法本质上是基于对一玻璃片或膜表面上固定的ｃＤＮＡ或寡核苷酸的分子杂交 ,这一新技术可同时测定成千上万个基因的作用方式 ,几周获得的信息用其它方法可能要几年才能得到 ,是以定量方式同时监测大量基因相对表达的强有力的新方法[1 ,2 ] 。国内外目前主要采用ｃＤＮＡ芯片进行基因表达的检测 ,芯片制备所用的ＤＮＡ探针一般为已知基因ｃＤＮＡ克隆的ＰＣＲ扩增产物或ＥＳＴ的扩增产物[3～ 8] 。对基因的表达检测来说 ,ｃＤＮＡ芯片技术是一条非常适用的检测方法 ,但在有…     

多药耐药基因分型芯片的制备及优化

目的:建立多药耐药基因(mdr1)分型芯片,以检测患者的单核苷酸多态性(SNPs)。方法:设计并合成探针和引物,制备芯片;构建野生型和突变型质粒,以其为模板经PCR仪扩增后,与芯片上的探针杂交,并用扫描仪分析结果。结果:构建了野生型和突变型质粒,与芯片杂交能很好地区分基因型;优化了制备条件,建立了分型标准。结论:该基因芯片是一种快速特异的基因分型方法。