基于同源重组的裂殖壶菌遗传转化体系的构建及验证

【目的】裂殖壶菌是一种能高效生产DHA的海洋真菌;基因工程技术已经成功应用在微生物改造和代谢机理研究中,利用基因工程技术对裂殖壶菌进行改造首先需要构建适合裂殖壶菌的遗传转化体系;【方法】本文利用电转化的方法将含有18S r DNA同源重组片段的ble基因导入裂殖壶菌中,通过zeocin抗性平板筛选出阳性菌株,并设计ble基因引物,以裂殖壶菌基因组为模板,进行PCR验证ble基因是否成功结合到裂殖壶菌染色体上。【结果】筛选获得的抗性菌株基因组上确实PCR出ble基因片段,对改造菌株与原始菌株进行发酵培养,发现改造后菌株在生物量、油脂含量、DHA含量及脂肪酸分布等方面和原始菌株基本一致。【结论】抗性基因的插入不会影响菌株的正常代谢,该体系的构建为后续其他外源基因导入奠定基础。     

变温对破囊壶菌FJN-10脂肪酸组分和蛋白质组的影响

[目的]以破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10为研究对象,研究不同培养温度和变温条件对菌体生物量、油脂含量、脂肪酸组分、关键基因转录以及蛋白质组的影响。[方法]通过摇瓶实验测定干重研究菌株的生长,提取油脂并经液相色谱分析脂肪酸组分;荧光定量PCR和二维电泳研究脂肪酸合成途径关键的碳链延长酶、脱饱和酶的转录水平和蛋白质的差异表达。[结果]28℃培养时,生物量达13.6 g/L,DHA占总脂肪酸含量达32.41%;15℃培养时,生物量为9.8 g/L,DHA占总脂肪酸含量达56.08%。变温培养下生物量最高可达13.9 g/L、油脂含量及DHA含量在较高的水平。28℃降至15℃时,△4脱饱和酶和△6延长酶基因基因的转录分别提高了3.9和2.5倍。[结论]变温条件下菌株生物量在11.8~13.6 g/L,菌体稳定期延长,DHA的含量可达45%以上。可为今后DHA的产业化提供基础数据。     

高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7诱变株的筛选

【目的】对野生菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变育种,筛选高产DHA突变株。【方法】采用UV诱变和化学药物胁迫筛选方式,以菌株的生物量、油脂产量、DHA产量作为筛选指标,获得高产DHA突变株。【结果】经鉴定获得一株DHA高产突变株PKU#PM003,该菌株传代4次后仍保持较好的遗传稳定性。摇瓶发酵后,PKU#PM003生物量产量高达6.62 g/L,比原始菌株5.95 g/L提高了11.26%,脂肪酸含量高达4.01 g/L,比原始菌株3.18 g/L提高了26.1%,DHA在脂肪酸中所占比例由29.97%增加到33.43%,产量提高了41.01%,油脂突变效果显著。【结论】突变株PKU#PM003可作为性状优良的工业化发酵生产菌种,并在DHA产量提升上仍具有巨大的空间。     

裂殖壶菌Schizochytrium sp. 20888产DHA培养条件优化

【目的】为了优化裂殖壶菌产DHA的培养条件,提高油脂中DHA含量。【方法】采用单因素试验和正交设计试验方案,针对分批培养时间、培养基碳、氮源的种类和浓度以及培养温度开展试验,采用重量法测定生物量、采用索氏提取法测定油脂总量,采用气相色谱法测定油脂DHA含量,考察培养条件对细胞油脂DHA含量的影响。【结果】最适培养时间为4 d,培养温度23°C,最优碳氮源组成为(g/L):葡萄糖65、甘油80、蛋白胨6、酵母粉4和谷氨酸钠8。【结论】裂殖壶菌Schizochytrium sp.20888在葡萄糖和甘油组成的复合碳源和由蛋白胨、酵母粉和谷氨酸钠组成的复合氮源的培养基中可以得到最优的DHA产量,细胞DHA含量能达到33.68%。     

西藏土壤中耐辐射阿氏芽胞杆菌T61的分离和鉴定

【目的】对分离自西藏土样的菌株T61进行分离、鉴定和UV辐射抗性分析。【方法】对菌株T61进行形态和生理生化鉴定;对16S r RNA基因进行克隆和测序,构建系统进化树;测定脂肪酸成分和GC含量,将T61与最相近种进行DNA-DNA杂交;测定T61的UV辐射抗性曲线。【结果】T61细胞杆状,长度约为2μm,直径约为1μm,革兰氏阳性,可产生内生孢子。G+C含量为38.02%。脂肪酸主要成分是C14:0 iso、C15:0 iso和C15:0 anteiso。16S r RNA基因与阿氏芽胞杆菌B8W22T和巨大芽胞杆菌IAM13418T相似度最高,分别达到99.93%和99.53%。DNA-DNA杂交分析表明,T61与阿氏芽胞杆菌B8W22T的相似度为81.4%,而与巨大芽胞杆菌IAM13418T的相似度只有50.3%。UV辐射抗性分析显示,T61 D10为100 J/m2,远高于辐射敏感的大肠杆菌K12和枯草芽孢杆菌等菌株。【结论】菌株T61是一株阿氏芽胞杆菌,命名为Bacillus aryabhattai T61,其对UV辐射具有较强的抗性。     

利用环境胁迫提高破囊壶菌二十二碳六烯酸生产的研究进展

破囊壶菌由于具备生产多种高值天然活性物质的能力，如二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)、角鲨烯和类胡萝卜素等，目前已被视为商业脂质生产的优质来源。本文首先对破囊壶菌的生态作用和生物技术价值进行介绍，并概述了脂肪酸的两条生物合成途径；其次重点阐述了NaCl、温度、溶氧和pH这4种环境胁迫因子对破囊壶菌生长、脂质积累、脂肪酸组成和DHA生产的影响；随后总结了当前利用环境胁迫因子的渗透调节策略、分段发酵策略和缓解氧化应激策略提升破囊壶菌DHA生物合成能力的研究现状；最后指出了破囊壶菌在环境胁迫的分子调控机制、分段式发酵策略、菌株进化及代谢工程等方面存在的问题，并对如何改进这些问题以及未来可能的发展方向进行了展望。该综述旨在为破囊壶菌实现高效工业化生产DHA提供有效的参考。     

鄱阳湖-乐安河段湿地耐Cu、Zn、Pb植物促生菌的分离、筛选及鉴定

【背景】植物促生菌因其对植物生长促进及增强抗逆性等优点在植物-微生物联合修复重金属污染土壤中具有良好应用潜力。在污染土壤中,土著植物促生菌能够更好地定殖并保证促植物生长能力的发挥。【目的】从常年受上游多种重金属污染的鄱阳湖-乐安河段湿地分离出一批具有多种重金属抗性的优势土著植物促生菌,以期为植物-微生物联合修复重金属污染湿地提供一批优质的菌种资源。【方法】从乐安河流域戴村受重金属污染的湿地土壤及水体中分离具有Cu、Zn、Pb抗性菌株,测定菌株的促植物生长特性[产IAA(Indole acetic acid)、溶磷、产铁载体及ACC(1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid)脱氨酶活性],挑选促生特性较好的菌株进行16S r RNA基因序列分析鉴定,并测定菌株对其他胁迫条件(抗生素、酸碱、盐)的耐受能力。【结果】分离得到22株能够同时耐受Cu 50 mg/L、Zn 400 mg/L、Pb 800 mg/L的菌株,其中10株表现出较好的促植物生长特性,对其进行16S r RNA基因序列分析鉴定,有4株属于Ralstonia sp.,3株属于Burkholderia sp.,另3株则分别属于Cupriavidus sp.、Stenotrophomonas sp.和Novosphingobium sp.。基于这10株菌抗性特征的聚类分析及主成分分析,结果与系统发育树分析结果高度一致。【结论】耐受多种重金属的土著植物促生菌的分离鉴定为重金属污染土壤的植物-微生物联合原位修复提供良好的微生物资源。     

玉米联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的分离鉴定与固氮特性研究

【目的】固氮微生物是生物固氮的主体,其菌种的选育更是生物固氮研究的基础。本实验室分离鉴定出一株新的固氮菌,并对其固氮相关活性进行初步研究。【方法】固氮菌采用Ashby无氮培养基进行分离纯化。通过形态特征分析、生理生化特征分析、16S r RNA基因序列分析和基因组扫描对固氮菌进行鉴定。利用靛酚蓝-分光光度法检测固氮菌的泌铵能力。固氮酶活性的测定使用乙炔还原法。【结果】从玉米根部分离到一株固氮菌株GXGL-4A,菌体短杆状,大小约为1.5μm×0.5μm,单个或常见2个菌体细胞串联在一起,革兰氏染色结果为阴性。16S r RNA基因序列分析结果表明该菌株与Kosakonia oryzae Fo8A1d 16S r RNA基因序列有95%的相似性,结合形态特征、生理生化特征和基因组扫描,将其命名为K.radicincitans GXGL-4A。对其进行固氮基因nif H的检测,经PCR扩增得到预期的296 bp条带;采用靛酚蓝-分光光度法,测得发酵液中铵态氮含量为2.5 mg/L,表明该菌株具有较好的泌铵能力。乙炔还原法测其固氮酶活性,以乙烯生产量表示,结果显示GXGL-4A菌株在无氮培养基上能够有效地还原乙炔,达到232.94 nmol C2H4/(m L·h)。【结论】菌株GXGL-4A是一株可较好地分泌铵的新的固氮菌,具有很好的研究价值。     

一株蜂粮源拮抗细菌的分离鉴定及其抑菌物质特性

【目的】为发掘和利用蜂粮中拮抗菌资源,对分离获得的拮抗细菌菌株PC2进行分类鉴定,并测定其发酵液抑菌物质基本特性。【方法】采用改良牛津杯双层平板法测定菌株发酵液抑菌谱及温度、p H、紫外线和蛋白酶对其抑菌活性稳定性的影响,菌株鉴定结合形态学、生理生化特征和16S r RNA基因序列分析,硫酸铵沉淀法和盐酸沉淀有机溶剂提取法进行抑菌活性物质的初步分离。【结果】从3种蜂粮中分离筛选得到17株拮抗菌株,其中1株细菌PC2以马铃薯葡萄糖液体培养基发酵制备的无菌发酵液对7种供试菌株具有较强抑制作用,经形态、生理生化特征及16S r RNA基因序列分析,将其初步鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株发酵液抑菌活性对温度、酸和紫外线具有较强的稳定性,对蛋白酶K、胃蛋白酶、碱性蛋白酶处理敏感。菌株发酵液存在抑菌蛋白和脂肽类物质。【结论】菌株PC2在食品保鲜和农业生防中具有潜在的开发应用价值。     

针茅内生细菌菌株265ZY4的鉴定及其生物学功能

【目的】为高寒草地针茅(Stipa capillata L.)内生细菌的开发和利用提供理论依据,为生物菌肥的研究提供有价值的菌种资源。【方法】利用常规分离方法从针茅中分离获得菌株265ZY4,采用平板对峙法、Salkowski比色法和钼锑抗比色法对该内生菌进行拮抗能力测定、产IAA以及溶磷、固氮能力测定。根据形态学和16S r RNA序列分析对菌株265ZY4进行鉴定,确定该菌株的分类学地位。【结果】菌株265ZY4对3种马铃薯真菌病害均有较好的抑制作用,且对马铃薯炭疽病(Colletotrichum coccodes)的拮抗作用最明显,抑菌率为83.03%;该菌株能分泌IAA,在不含色氨酸的培养基中的分泌量为9.30 mg/L,且有较好的溶解无机磷的能力,无固氮能力;通过培养性状和形态特征,结合16S r RNA序列分析,将菌株265ZY4鉴定为Bacillus subtilis。【结论】菌株265ZY4鉴定为枯草芽孢杆菌B.subtilis,具有溶磷、产IAA等生物学功能,具有开发潜力。     

两种培养基对对虾苗池海洋蛭弧菌的分离及其多样性分析

【目的】明确海水(Sw)和聚蛋白胨20(Pp20)两种双层琼脂培养基对海洋蛭弧菌的分离计数效果,了解对虾苗池可培养海洋蛭弧菌多样性。【方法】采用双层平板法,比较Sw和Pp20培养基对2株海洋蛭弧菌和对虾苗池未知海洋蛭弧菌的计数效果。通过宿主范围测试和16S rRNA基因序列分析评估两种培养基分离苗池海洋蛭弧菌的多样性。【结果】宿主菌含量高时,Sw培养基对两株已知海洋蛭弧菌的计数值均显著高于(P0.05)Pp20。Sw和Pp20培养基从同一苗池水样分别分离得到21和22株蛭弧菌。根据宿主裂解范围差异,43株分离物可分为15种裂解模式,其中Sw和Pp20培养基各分离到12和8种。16S rRNA基因序列分析表明,所有分离物都被鉴定为噬菌弧菌属(Bacteriovorax)菌株,并可分为6个类群,Sw和Pp20培养基分别分离到6和4个类群。【结论】Sw培养基在分离计数海洋蛭弧菌及其多样性检测上效果均优于Pp20;对虾苗池可培养海洋蛭弧菌具有较高多样性,并以类群XIII、X及一个潜在新类群为优势种群。     

一株高效降解芘的细菌分离、鉴定及其降解效果

摘要：【目的】获得高效降解高分子量多环芳烃的细菌,并研究其对多环芳烃的降解能力。【方法】利用富集培养和芘升华平板方法,从焦化厂污染土壤中分离多环芳烃降解细菌,对分离菌株通过形态特征、16S rRNA基因和gyrb基因序列相似性分析进行鉴定,并研究该菌对高分子量多环芳烃（HMW-PAHs）的降解效果。【结果】筛选到一株能以芘、苯并蒽、屈、苯并芘、茚并芘、苯并苝、荧恩为碳源和能源生长并降解这些底物的菌株HBS1,该菌株的16S rRNA基因和gyrb基因序列与Gordonia amicalis的相应基因的相似     

具杀线虫活性植物内生细菌的筛选和活性产物

【目的】植物寄生线虫是危害植物的重要病原物,为了筛选到能在植物体内稳定定殖并且对植物寄生线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌生防菌。【方法】以松材线虫为靶标,用直接触杀法进行筛选。对高活性菌株采用正交实验优化发酵条件,测定发酵液杀线虫活性的稳定性,并对菌株进行鉴定。【结果】从6种植物中分离筛选出13株对松材线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌菌株,这些菌株的发酵上清液对松材线虫处理24h杀线虫率均达到了100%;其中BCM2、SZ5、CCM7和DP1这4个菌株的杀线虫活性较高,发酵上清液稀释3倍处理24h杀线虫率均达到95%以上,DP1和SZ5菌株达到了100%;并发现部分菌株发酵液能使线虫虫体发生渗漏或消解。发酵条件优化后能使发酵液杀线虫效果提高4倍。4株高活性菌株产生的杀线虫物质均对蛋白酶稳定、耐热不耐酸碱且长时间保藏活性不下降。经过鉴定DP1和CCM7是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),BCM2和SZ5是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】经济作物体内存在一定数量的能产生杀线虫活性物质的内生细菌,其中一些细菌产生的杀线虫物质具有较强的稳定性。认为杀线虫活性的植物内生细菌具有很大的生防潜力。     

DHA高产菌Schizochytrium sp.FJU-512脂肪酸组成与18S rRNA基因序列分析

采用松花粉垂钓法分离到一株docosahexaenoic acid(DHA)高产菌FJU-512。该菌株DHA含量高(占总脂肪酸的56．24％),其它长链杂酸含量少(仅有Docosapentraenoic acid,二十二碳五烯酸,DPA),极具开发应用价值。高密度培养获得33g／L生物量。该菌株呈二分裂生长,没有分生孢子。对其18S rRNA基因进行了克隆测序并登录GenBank(AY758384)。依据18S rRNA基因建立的系统进化树表明：该菌与Schizochytrium limacinum具有紧密的亲缘关系。     

Culturable diversity and biochemical features of thraustochytrids from coastal waters of Southern China

Thraustochytrids are ubiquitous marine osmo-heterotrophic fungi-like microorganisms with only about 40 identified species till now. In this study, a total of 60 thraustochytrid strains were isolated from marine coastal habitats. Analysis of 18S rRNA gene sequences revealed that they belonged to three genera, i.e., Schizochytrium, Aurantiochytrium, and Thraustochytrium. All of the isolates were found to show considerable cellulolytic and lipolytic activities. Strains of Aurantiochytrium sp. and Thraustochytrium sp. were found to produce the highest levels of extracellular polysaccharides (EPS), which reached 345 μg ml^?1 in the growth media. Fourier transform infrared (FTIR) spectra of the EPS samples derived from two thraustochytrids (PKU#Sed1 and #SW1) displayed peaks for carbohydrates, proteins, lipids, uronic acids, and nucleic acids. Fatty acid profiles of four thraustochytrids comprised of palmitic acid (C16:0) and docosahexaenoic acid (DHA) as their major constituents. Schizochytrium sp. demonstrated the highest DHA production at 44 % of total fatty acids (TFA) with biomass and DHA yield of 7.1 and 1.6 g l^?1, respectively, on the fourth day of growth. All the four isolates exhibited considerable production of palmitic acid (16:0) in their fatty acid profiles ranging from 35 to 50 % TFA. This is the first report on extracellular enzymes, EPS, and DHA production from thraustochytrids isolated from the coastal habitats of China.     

Isolation and Characterization of Taiwanese Heterotrophic Microalgae: Screening of Strains for Docosahexaenoic Acid (DHA) Production

Marine heterotrophic microalgal species which are potentially rich in docosahexaenoic acid (DHA, C22:6n−3) have been found in Taiwan; however, there was a lack of detailed analysis and characterization of these indigenous algae which is needed for the development of commercial applications. Hence, the objective of this study was to screen DHA-rich heterotrophic microalgae species indigenous to Taiwan for commercial purposes. Heterotrophic microalgae from a variety of marine habitats were isolated, cultivated, and then identified according to their 18S rRNA gene sequences and morphological characteristics. A comparison was made of their fatty acid profiles, fatty acid content, and amount of biomass. For the strain with highest DHA yield, the optimal growth conditions were determined in order to establish the best fermentation conditions for scale-up. In this study, 25 heterotrophic microalgal strains were successfully isolated from marine habitats around Taiwan. All of the isolated strains showed a close phylogenic relationship with the Thraustochytriaceae family according to their 18S rRNA gene sequences. GC/MS analysis discerned seven distinctive fatty acid profiles of these strains, with the production of eicosapentaenoic acid (C20:5n−3) ranging from 0.02 to 2.61 mg L⁻¹, and DHA ranging from 0.8 to 18.0 mg L⁻¹. An Aurantiochytrium strain BL10 with high DHA production was subsequently chosen for further manipulation. Under optimal growth conditions it could produce up to 59.0 g of dry biomass per liter of culture, with dry biomass containing 73% total fatty acid and 29% DHA, revealing BL10 as an excellent source of microbial DHA.     

代表性差异分析比较两株来自不同地区的猪源Lactobacillus菌株

[目的]对分离自猪肠道的乳酸杆菌S1菌株进行鉴定,并比较该菌株与同种的001T菌株的基因差异.[方法]对S1菌株进行16S rRNA基因序列分析和种特异PCR检测,并且对S1菌株和Lactobacillus sobrius 001T进行代表性差异分析(Representational difference analysis,RDA).[结果]16S rRNA基因序列分析表明,与S1菌株最相似的已知菌为L.sobrius.变性梯度凝胶电泳分析显示,仔猪空、回肠细菌图谱中有一与S1菌株有相同迁移位置的优势条带,克隆、测序鉴定表明,与该条带相匹配的16S rRNA基因克隆(Clone S)的最相似已知菌也为L.sobrius.16S rRNA基因系统进化分析表明,S1菌株与Clone S和L.sobrius 16S rRNA基因序列同源性分别为99.8%和99.6%.L.sobrius特异性引物也可以扩增S1株菌的16S rRNA基因的特定片段.因此S1菌株可被确定为Lsobrius.RDA对菌株S1和同种的猪源L.sobrius 001T菌株的基因差异进行分析,未发现这两株菌的基因组差异.[结论]猪肠道乳杆酸菌S1菌株属于L.sobrius,其与猪源L sobrius 001T菌株为相似菌株.     

杜仲黑斑病菌(Pestalotiopsis trachicarpicola)拮抗细菌的分离和鉴定

【背景】杜仲黑斑病菌(Pestalotiopsis trachicarpicola)是引起杜仲黑斑病的新病原,当前尚未见生防菌对其产生拮抗作用的报道。【目的】从杜仲健康叶片上分离筛选出对P.trachicarpicola DZHBB-1拮抗效果最好的生防芽孢杆菌(Bacillussp.),利用16SrRNA基因结合蛋白质编码基因,实现对该菌株的快速准确鉴定。【方法】采用稀释分离法从健康杜仲叶片上分离菌株,通过平板对峙实验和生长速率法进行筛选,联合16SrRNA、gyrA、gyrB基因序列构建系统发育树分析,结合形态学特征及生理生化特性鉴定目标菌株,盆栽试验验证其对杜仲黑斑病的防治效果。【结果】总共分离得到62株芽孢杆菌,初筛出14株对病原菌有较好生防效果的菌株,复筛结果证明菌株J1拮抗效果最好且稳定,抑制率达到66.67%,16SrRNA、gyrA、gyrB基因序列系统发育树分析结果综合显示,菌株J1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。盆栽试验结果显示,该菌能有效防治杜仲黑斑病的发生,防治效果均超过57%。【结论】该菌株具有防治P. trachicarpicola引起相关植物病害的生防潜力,16S rRNA、gyrA、gyrB基因联合鉴定芽孢杆菌,可为快速准确地鉴定芽孢杆菌及其近缘种提供借鉴方法。     

九香虫(椿象)体内可培养细菌的多样性分析

【目的】认识药用昆虫九香虫(Aspongopus chinesis Dallas)成虫体内可培养细菌资源多样性。【方法】运用纯培养法、反转录重复因子扩增(BOXA1R-PCR)分析技术、16S r RNA基因测序和系统发育分析对样品中可培养细菌进行多样性研究,测定了分离菌株的抗菌特性、吲哚乙酸(IAA)含量和产淀粉酶活性等指标。【结果】通过6种不同培养基共分离得到52株菌落特征不同的细菌菌株。基于菌落特征和BOXA1R-PCR图谱选取12株代表菌株用于16S r RNA基因序列测定。16S r RNA基因序列系统发育分析显示,52株菌株分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)4个属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。分离到的52株细菌有44株(占总分离菌株的84.6%)表现出对供试病原菌具有较好的抑制作用,高达94.2%的分离菌株能产IAA,有43株(占总分离菌株的82.7%)表现出淀粉酶活性。【结论】九香虫内细菌种群较为多样,具有潜在应用价值。