细菌性阴道病患者阴道分泌物16SrDNA序列分析

目的分析健康妇女及细菌性阴道病(Bacterial vaginosis,BV)患者阴道分泌物16S rDNA序列。方法提取20例健康妇女及40例BV患者阴道分泌物标本中的总DNA,针对细菌16S rDNA保守区设计通用引物进行PCR扩增、克隆、测序,将获得的16S rDNA序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中的发表序列进行比对,分析克隆群中细菌种类和比例。结果通过阴道分泌物16S rDNA序列分析,发现健康妇女阴道分泌物中以卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus),惰性乳酸杆菌(Lactobacillus iners),加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)为优势菌种,而BV患者阴道菌群种类繁多,以加德纳菌属(Gardnerella)和奇异菌属(Atopobium vaginae)克隆子占较大比例,仅4例患者可见卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus),其他患者均未见有乳酸杆菌克隆子且奇异菌属阴道病患者甲硝唑治疗疗效较差。结论健康妇女和BV患者阴道分泌物菌群种类有较大区别,BV患者在治疗前进行16S rDNA序列分析检测有较大的临床意义。     

用细菌16S rRNA荧光定量PCR法检测肠道菌群的变化

目的应用细菌的16SrRNA序列设计双歧杆菌、大肠埃希菌及乳酸杆菌的引物并对肠道的3种细菌进行定量测定。方法收集轮状病毒肠炎患儿及正常对照组的粪便标本提取DNA。取准确定量的3种细菌经系列稀释后抽提细菌的DNA做荧光定量PCR,制作出标准曲线。待测样品同时进行PCR反应并和标准曲线进行比较,获得各样品中3种细菌的量。结果患儿肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量较正常儿童明显减低,而大肠埃希菌的数量差异无显著性。与其他文献报道的用细菌培养的方法所得结果一致。结论荧光定量PCR是一种特异性高、敏感性强的定量方法。可正确定量肠道中的细菌数量。     

应用实时荧光定量PCR定量检测溃疡性结肠炎肠道大肠埃希菌、乳酸杆菌及双歧杆菌属的变化

目的应用实时荧光定量PCR（RT—PCR）法对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）患者粪便中大肠埃希菌、乳酸杆菌及双歧杆菌属的数量进行定量检测分析。方法根据细菌的16SrDNA基因序列设计大肠埃希菌、乳酸杆菌及双歧杆菌属的种属特异性引物。收集溃疡性结肠炎患者及正常对照者新鲜粪便标本各35例,从待测粪便标本中提取细菌基因组DNA,进行实时荧光定量PCR反应,定量分析不同细菌的数量。结果正常对照组与病例组粪便中细菌数量分别为大肠埃希菌（4．62±1．10;5．27±1．02）、乳酸杆菌属（4．99±0．75;4．65±0．95）、双歧杆菌属（5．07±0．95;4．93±0．99）,病例组大肠埃希菌数量明显增多（t=2．540,P=0．013）,而乳酸杆菌及双歧杆菌属数量与正常组比较差异无统计学意义（t1=0．488,P,=0．530;t2=-0．533,P：=0．596）。结论溃疡性结肠炎患者粪便中大肠埃希菌的数量较正常对照明显增多,而乳酸杆菌及双歧杆菌属的数量无明显变化,提示大肠埃希菌与溃疡性结肠炎的发病或复发有关系,而乳酸及双歧杆菌属与此病的关系有待进一步研究。     

粪便中肠球菌SYBR GreenI荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法,建立肠球菌实时荧光PCR检测方法,并初步应用于粪便中肠球菌的检测。方法根据GenBank发表的肠球菌23S rRNA基因序列的保守区域设计合成特异性的引物;利用构建的质粒标准品绘制两种标准曲线,构建基因拷贝数、细菌数为分析指标的定量分析模型并初步应用于粪便标本的检测分析。结果所建立的SYBR GreenI荧光定量PCR方法检测灵敏度可达7个拷贝数/reaction。粪便样本根据实时荧光定量PCR方法所得的理论数值与培养菌值之间差异无显著性(P>0.05)。非炎性腹泻标本中菌数与健康成人标本中菌数差异无显著性(P>0.05)。灵敏度曲线所得的数值大于菌数标准曲线,可能由于DNA提取过程中存在部分的损失。检测粪便标本结果显示SYBR GreenI荧光定量PCR方法较平板计数法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的肠球菌定量检测方法。     

应用qPCR方法快速定量检测阴道分泌物中乳杆菌的研究

目的建立快速、定量检测女性阴道分泌物中乳杆菌的方法。方法合成针对乳杆菌的特异性引物,建立乳杆菌qPCR标准曲线后,进一步对收集得到的健康女性及细菌性阴道病女性阴道分泌物样品中乳杆菌进行定量检测。结果引物仅扩增出乳杆菌特异性DNA条带,qPCR能够检测到各分泌物样本中乳杆菌的数量。结论建立了一种快速、定量女性阴道分泌物中乳杆菌检测方法。     

应用real-timePCR法快速定量人类粪便中双歧杆菌的研究

目的建立快速、准确从粪便标本中定量双歧杆菌的RT—PCR技术。方法传统培养定量法,普通PCR定量法,real—timePCR比较测量。结果（I）粪便标本前处理采取简单的离心和清洗、稀释步骤能去除粪便标本中的抑制物,实现不提取DNA直接进行PCR、real—time定量粪便中双歧杆菌。（2）本实验建立的PCR方法直接半定量粪便双歧杆菌技术在双歧杆菌值介于10^3～10^7CFU／ml时具有较好的分辨率,粪便标本普通PCR得理论菌数与培养得菌数值之间差异无显著性（P〉0．05）;real-timePCR直接定量双歧杆菌技术在双歧杆菌值介于10^1-10^7CFU／ml时具有较好的分辨率,粪便标本RT—PCR得理论菌数与培养得菌数值之间差异无显著性（P〉0．05）。结论利用PCR、real—timePCR直接半定量和定量粪便中的双歧杆菌可行。     

通过特异PCR扩增和16S rDNA序列分析检测动弯杆菌

细菌性阴道病 (BacterialVaginosis,BV)是由于细菌过度生长所致阴道微生态非正常改变 ,从而导致的一类多微生物病 (PolymicrobialDiseases)。动弯杆菌 (Mobiluncussp .)与BV发生有密切关系 ,但该菌为厌氧菌 ,营养要求苛刻 ,很难进行纯培养 ,国内鲜有研究报道。本文先对BV动物模型恒河猴阴道分泌物进行厌氧菌混合培养 ,抽提混合物染色体DNA ,之后设计了一对动弯杆菌 16SrRNA基因的特异性引物 ,用PCR的方法扩增出了特异片段。通过对扩增产物进行测序分析 ,确定检测出的为动弯杆菌 ,并且与羞怯动弯杆菌极为相似     

通过特异PCR扩增和16SrDNA序列分析检测动弯杆菌

细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis,BV)是由于细菌过度生长所致阴道微生态非正常改变,从而导致的一类多微生物病(Polymicrobial Diseases)。动弯杆菌(Mobiluncus sp．)与BV发生有密切关系,但该菌为厌氧菌,营养要求苛刻,很难进行纯培养,国内鲜有研究报道。本文先对BV动物模型恒河猴阴道分泌物进行厌氧菌混合培养,抽提混合物染色体DNA,之后设计了一对动弯杆菌16SrRNA基因的特异性引物,用PCR的方法扩增出了特异片段。通过对扩增产物进行测序分析,确定检测出的为动弯杆菌,并且与羞怯动弯杆菌极为相似。     

体检妇女阴道分泌物微生态学变化与年龄关系的探讨

为探讨不同妇女阴道分泌物微生态学变化规律,以形态学方法检出２６８名教工及干部体检妇女阴道分泌物中的细菌群态及原体,并以试纸法测定ｐＨ。结果经年龄分组统计,发现年龄在２５岁－６０岁范围内,阴道分泌物中乳酸杆菌样菌、ｐＨ＜４．５值以及念珠菌和细菌性阴道病（ＢＶ）的检出率均随着年龄的增长在明显下降。提示在体检妇女阴道分泌物中,乳酸杆菌、ｐＨ＜４．５值、念珠菌和ＢＶ的检出率与年龄有关。     

健康妊娠妇女阴道乳酸杆菌及pH变化的研究

目的研究健康妊娠妇女阴道乳酸菌数量及pH的变化与妊娠时间的关系。方法选择20例健康非妊娠妇女,60例健康妊娠妇女(其中早期妊娠、中期妊娠及晚期妊娠各20例)阴道分泌物进行乳酸杆菌数量检测及pH测定,并对乳酸杆菌产生过氧化氢的情况进行检测。结果随着妊娠时间的增加,乳酸杆菌的数量明显增高,伴随阴道分泌物的pH逐渐降低。结论乳酸杆菌与健康妊娠妇女阴道的生物屏障和酸性环境的维持有重要关系。     

荧光定量PCR监测五氯酚对好氧颗粒污泥和活性污泥中氨氧化细菌数量的影响

通过特异引物扩增环境中氨氧化细菌16S rDNAV2保守区域,将该片段克隆到T-easy载体上,PCR产物经测序和定量PCR扩增体系鉴定,证实PCR扩增产物为氨氧化细菌16S rDNA保守序列,以含该序列的重组质粒作为定量PCR监测氨氧化细菌数量的DNA标准品。用荧光定量PCR技术比较了五氯酚(PCP)对好氧颗粒污泥和活性污泥中氨氧化细菌数量的影响。结果表明,不加PCP的反应器中,好氧颗粒污泥和活性污泥中氨氧化细菌的数量分别为4.28×107±5.44×106cells/(g干污泥)和2.51×109±8.61×108cells/(g干污泥)。随着PCP浓度的增加(0~50mg/L),PCP对氨氧化细菌数量的影响不大(P>0.05),而且,污泥中氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接的正相关关系(P>0.05),PCP主要是抑制氨氧化细菌的代谢活性导致污泥氨氮去除效率降低。     

SELEX技术筛选变形链球菌UA159适配子可行性的研究

目的:研究SELEX技术用于筛选口腔致龋菌适配子的可行性。方法:化学合成长度为35mer的随机ssDNA文库,利用SE-LEX技术,分别以变形链球菌UA159(以下简称变链UA159)、乳杆菌和离心管作为靶物质,筛选适配子,不对称PCR扩增筛选产物,所得适配子进行克隆、测序,分析其二级结构,并对其二级结构进行了初步分析。结果:显示各个靶物质的筛选产物在第二轮筛选时就已经表现出具有特征性的二级结构。结论:SELEX技术可以用于口腔致龋菌适配子的筛选。     

胎膜早破与孕妇阴道微生态 及血清IL-10、IL-22、NF-κB的相关性

摘要：目的 探讨胎膜早破与孕妇阴道微生态及血清IL-10、IL-22、NF-kB的相关性。方法 选取我院妇产科收治的84例胎膜早破孕妇为胎膜早破组,100例正常孕妇为正常孕妇组及100例正常未怀孕妇女为正常妇女组。比较3组对象阴道分泌物各细菌阳性率、阴道微生态状态及各组间血清IL-10、IL-22、NF-kB水平。对胎膜早破孕妇阴道微生态失衡与血清IL-10、IL-22、NF-kB水平进行Pearson相关性分析。结果 胎膜早破组孕妇阴道乳杆菌（79.8%）、大肠埃希菌（48.8%）、溶血葡萄球菌（22.6%）检出率均显著高于正常孕妇组和正常妇女组（均P<0.05）。胎膜早破组患者阴道pH（6.87±0.75）、阴道微生态失衡率（40.5%）均显著高于正常孕妇组和正常妇女组,H2O2阳性率（11.9%）低于正常孕妇组（21.0%）和正常妇女组（23.0%）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。胎膜早破组孕妇血清IL-10、IL-22、NF-kB水平[（51.28±6.58）pg/mL、（45.91±7.13）pg/mL、（30.47±3.27）ng/mL]均显著高于正常孕妇组和正常妇女组。经过Pearson相关性分析,IL-10、IL-22、NF-kB水平与胎膜早破孕妇阴道微生态失衡呈正相关（r=0.657、0.692、0.732,P<0.05）。结论 孕妇阴道微生态环境发生改变引起阴道菌群失调及血清免疫因子的变化,可能是引发胎膜早破的作用机制之一。     

Quantitative selective PCR of 16S ribosomal DNA correlates well with selective agar plating in describing population dynamics of indigenous Pseudomonas spp. in soil hot spots

We used a quantitative PCR method targeting 16S ribosomal DNA using competitive PCR for specific detection of indigenous Pseudomonas DNA in soil hot spots. The amount of Pseudomonas DNA corresponded to the number of culturable Pseudomonas bacteria on Gould's S1 agar. This represents the first use of PCR for quantification of indigenous bacteria in more than one sample of soil.     

Comparison of agar plate and real-time PCR on enumeration of Lactobacillus, Clostridium perfringens and total anaerobic bacteria in dog faeces

AIMS: To compare agar plate and real-time PCR methods on enumeration of total anaerobic bacteria, Lactobacillus and Clostridium perfringens in dog faeces. METHODS AND RESULTS: Thirty-two faecal specimens from Labrador retriever dogs were used to compare agar plate and real-time PCR enumeration methods for Lactobacillus, C. perfringens and total anaerobic bacteria. Total anaerobic bacteria, C. perfringens and Lactobacillus of faeces were counted (as CFU g(-1) faeces) for 48-h incubation at 37 degrees C in an anaerobic gas chamber on genus-selective media. Total genomic DNA from samples was extracted by the QIAamp DNA stool mini kit. The quantification of DNA (as DNA copy per gram faeces) by real-time PCR was performed with a LightCycler system with the QuantiTect SYBR green PCR kit for PCR amplification. The results indicated that there was a significant correlation between CFU and DNA copy of Lactobacillus (R2 = 0.78, P < 0.01) and total anaerobic bacteria (R2 = 0.21, P < 0.05); but no correlation was found between CFU and DNA copy of C. perfringens. The regression equations for Lactobacillus and total anaerobic bacteria were log(DNA copy) = 0.83 x log(CFU) + 1.43 and log(DNA copy) = 1.62 x log(CFU) - 6.32 respectively. CONCLUSIONS: The real-time PCR method could be used to enumerate Lactobacillus within 2 days when compared with plating method which requires 5-6 days. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: The real-time PCR method and the primer set for Lactobacillus spp. harboured in the dog intestine can be used for rapid enumeration of lactobacilli and monitoring of the faecal Lactobacillus community.     

Quantitative Selective PCR of 16S Ribosomal DNA Correlates Well with Selective Agar Plating in Describing Population Dynamics of Indigenous Pseudomonas spp. in Soil Hot Spots

We used a quantitative PCR method targeting 16S ribosomal DNA using competitive PCR for specific detection of indigenous Pseudomonas DNA in soil hot spots. The amount of Pseudomonas DNA corresponded to the number of culturable Pseudomonas bacteria on Gould’s S1 agar. This represents the first use of PCR for quantification of indigenous bacteria in more than one sample of soil.     

Rapid estimation of spoilage bacterial load in aerobically stored meat by a quantitative polymerase chain reaction

We report a quantitative PCR which utilizes primers from a conserved 23S rDNA sequence identified in nine different spoilage bacteria commonly present in meat. The PCR detected the spoilage bacteria by amplifying a specific 207 bp sequence from their chromosomal DNA. Quantification of PCR product by electrochemiluminescence revealed that the concentration of the amplified product was dependent on cycle number and the initial number of bacteria present in the sample. Statistical analysis of the results indicated a correlation coefficient of 0.94 (P < 0.001) between aerobic plate count and QPCR luminosity units.     

Rapid quantification of periodontitis-related bacteria using a novel modification of Invader PLUS technologies

The Invader PLUS technology is a sensitive, rapid method for the detection and quantification of nucleic acid. While the original technology is based on the amplification by polymerase chain reaction (PCR) of the target sequence followed by its detection using the Invader technology, the current modification allows simultaneous PCR amplification and Invader reaction. The PCR primers and the Invader probes are designed to operate at the same temperature. This allows simpler design and faster results. This technology has been applied for the quantification of six periodontitis-related bacteria (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Toreponema denticola, Tannerella forsythensis and Fusobacterium nucleatum). Direct comparison of this modified Invader PLUS with real-time PCR demonstrated similar linear range. Furthermore, testing of 64 volunteers showed a good correlation between both technologies with correlation factors r2 spanning between 0.827 and 0.987. We demonstrated here that the proposed improvement of the Invader PLUS allows the detection and quantification of DNA sequences using a simple design and protocol that can be implemented in clinical testing.