高产莫纳可林K低产桔霉素红曲霉菌株的筛选和发酵条件初步优化

采集全国各地红曲霉制品中的红曲霉资源,经分离获278株红曲霉菌株。高效液相色谱(HPLC)法测定各菌株发酵液中莫纳可林K(Monacolin K)和桔霉素含量,筛选获1株Monacolin K产量较高、桔霉素含量较低的红曲霉菌株编号为M-22。依据形态特征和ITS基因序列,参照红曲霉属分类检索表,鉴定M-22菌株为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。通过摇瓶发酵对温度、初始pH、碳源、氮源、碳氮比(C/N)等因素进行优化,确定M-22菌株摇瓶发酵产Monacolin K适宜条件为发酵温度26℃、初始pH 5.0、转速160 r/min,甘油为碳源、蛋白胨为氮源、碳氮比(C/N)为5:1,Monacolin K产量显著提高,最高为107.16 mg/L。以优化的发酵条件对M-22菌株进行5 L发酵罐发酵,发酵液中Monacolin K产量最高为189.83 mg/L,桔霉素含量32.53μg/L,红曲色素色价为16.38 U/m L。     

高产Monacolin K纯种红曲培养条件的研究

本实验对已有的十株红曲霉菌株进行纯种制曲,筛选出一株生长良好、Monacolin K含量高、不产桔霉素、产色素能力强及糖化酶活力相对较高的红曲霉菌株.以大米为原材料,采用液固联合制曲法,通过单因素实验对纯种红曲的培养条件进行优化.结果表明,固体培养基初始含水量为45％,接种量为8％,变温培养红曲时,红曲霉M-7所得纯种红曲最佳,其Monacolin K含量高达243 μg/g,色价450 U/g,糖化酶活力4 289 U/g.与优化之前比较,Monacolin K含量提高了37.2％.     

一株高产洛伐他汀红曲霉的筛选与液态发酵条件优化

【背景】洛伐他汀(lovastatin)是红曲霉的次生代谢产物,是重要的临床用降血脂药物。在液态发酵条件下,红曲霉的洛伐他汀产量较低,难以满足工业化生产的要求。【目的】筛选获得一株高产洛伐他汀的红曲霉株,并通过优化液态发酵条件提高洛伐他汀的产量。【方法】从红曲米中筛选获得一株高产洛伐他汀的红曲霉株,依据形态学特征、生理生化特性及18S rRNA基因序列分析对分离菌株进行鉴定;通过响应面法对其产洛伐他汀的液态发酵条件进行优化。【结果】获得一株产洛伐他汀的紫红曲霉(Monascus purpureus M4),该菌在甘油57.80g/L、酵母浸粉5.52 g/L、接种量为6.90%条件下,洛伐他汀产量(173.60 mg/L)较优化前提高了4.8倍。【结论】菌株M4产洛伐他汀最优液态发酵条件的建立,为洛伐他汀的大规模生产及该菌株的工业化应用提供了技术支撑。     

农杆菌介导的紫色红曲霉遗传转化体系的建立和优化

通过优化各种转化因素,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导红曲霉(Monascus)的高效转化体系:红曲霉在PDA培养基培养21 d后收集孢子,制备红曲霉孢子悬浮液,浓度为106个/mL,根癌农杆菌浓度为OD600值0.5,诱导剂AS浓度为100μmol/L,农杆菌与红曲霉在25℃共培养3 d。采用此转化体系构建了含有530多个转化子的红曲霉T-DNA插入突变体库。随机选取50株转化子菌株进行分子验证和稳定性检测,证明T-DNA成功插入红曲霉基因组DNA中,并能稳定遗传。最后,通过形态观察筛选出8株变异较大的菌株,为以后的红曲霉基因功能研究奠定了一定的基础。     

高产降胆固醇活性物质的红曲霉菌种选育研究

红曲霉出发菌株经紫外线 (UV)、硫酸二乙酯 (DES)、氯化锂 (LiCl)等诱变剂反复诱变处理 ,获得供试红曲霉菌株 10株。用薄层层析法初筛得到可能产MonacolinK的菌株 4株 ,再经高效液相色谱法对初筛菌株进一步进行检测 ,证实其中 3株具有较强的产MonacolinK能力 ,特别是诱变株M7的含量与出发菌株相比提高了 4 1倍     

高产γ-氨基丁酸低产桔霉素红曲霉(Monascus ruber)突变子1047筛选与发酵特性研究

以红曲米中筛选到的红色红曲霉菌株G为原始菌株,通过农杆菌介导T-DNA插入突变技术,成功构建了含有1 483株红曲霉突变子的T-DNA插入突变库。用HPLC等方法从突变库中筛选出10株γ-氨基丁酸(GABA)产量稳定高于原始菌株G的突变子,薄层层析结合HPLC技术分析了10株突变子发酵液中桔霉素的含量;其中突变子1047的GABA产量较高,为1.169g/L,是原始菌株G(GABA产量0.472g/L)的247.67%,桔霉素含量稳定低于原始菌株G。以红曲霉菌株G和突变子1047为实验材料,通过5 L发酵罐发酵并定时取样,HPLC等方法精确分析发酵液各种活性物质的含量;结果显示,突变子1047生长速度稍快于原始菌株G;GABA、莫纳可林K(Monacolin K)、红曲色素色价分别为2.201 g/L、83.892 mg/L、21.984 U/mL,是原始菌株G的279.67%、108.01%和182.35%;而桔霉素产量为1.976 mg/L,是原始菌株G的41.71%。因此,利用TDNA插入的方法对红曲霉进行育种,能产生稳定的遗传变化,在红曲霉资源的保护和利用上有一定潜力。     

红曲霉T-DNA插入突变库中色素突变子的筛选

红曲霉（Monascus purpureus）是我国重要的传统食用和药用微生物,能分泌红曲色素、莫纳卡琳（Mo-nacolin K）、γ-氨基丁酸、麦角固醇等物质,被广泛用于生产食品发酵剂、食品着色剂、保健食品和药品等,在我国有上千年的应用历史。本实验以根癌农杆菌（Agrobacterriumtum efaciens）介导的红曲霉突变体库中754株突变子菌株为材料,通过乙醇提取法筛选出了9株产红曲色素发生显著变化的色素突变子,其中S50在505 nm波长处的色价降为原始菌株S的0.12倍,几乎变为白化株。300~600 nm波长下UV-VIS扫描图谱特征显示,色素突变子不仅色价发生了变化,而且吸收波长、吸收峰值也发生了不同程度的变化。最后,对色素突变子菌落形态、显微结构、潮霉素抗性、遗传稳定性以及产桔霉素能力等进行分析,为研究红曲霉产色素相关基因奠定了基础。     

冷冻干燥保藏曲霉菌种的效果

本文报告了用冷冻干燥法保藏曲霉属（Aspergillus）5种8株曲霉的效果,并分别对这些曲霉菌株的糖化酶活力进行检测。这些曲霉菌株经过冷冻干燥保藏8年后全部保持生活能力,其培养及形态特征除一株生长稍差外,其余菌株均保留原有形状,测定其糖化酶活力未有明显变化。     

一株Monacolin K高产菌株生理特性

根据丝状真菌的常用鉴定方法,对实验室保存的一株Monacolin K高产菌株进行形态和生理特性实验。结果表明该菌株属于真菌门(Eumycophyta)、子囊菌纲(Asomycetes)、真子囊菌亚纲(Eurotiaceae)、曲霉目(Eurrotiales)、曲霉科(Eurotiaceae)、红曲霉属(Monascus)。     

深圳大鹏湾六种珊瑚共附生真菌多样性研究

本研究使用6种不同培养基对深圳大鹏湾6种珊瑚上的共附生真菌进行平板涂布法分离培养,结合ITS-rDNA基因序列特征和形态学特征进行鉴定来研究深圳大鹏湾海域珊瑚共附生真菌的多样性。共分离培养出457株真菌菌株,分属于7个属,分别为红酵母属Rhodotorula（180株）、曲霉属Aspergillus（170株）、木霉属Trichoderma（50株）、青霉属Penicillium（34株）、枝孢属Cladosporium（21株）、透孢黑团壳属Massarina（1株）和弯颈霉属Tolypocladium（1株）,其中优势属为红酵母属Rhodotorula和曲霉属Aspergillus,占菌株分离总数的76.59%。单独鹿角珊瑚上分离到的共附生真菌数量和种类最多,为160株9种;在该种珊瑚上还分离出弯颈霉属Tolypocladium sp.,该属真菌此前从未在珊瑚共附生真菌的研究中分离出来。本研究还发现SDA培养基分离出的共附生真菌数量最多,CDA培养基的真菌数量最少,表明不同培养基分离的共附生真菌多样性存在差异。     

红曲中桔霉素的检测及控制

红曲是指以大米为原料,用红曲菌属（Monascusspp．）红曲霉发酵培养制得,具有红色的颗粒或用其制成的粉末。目前红曲可分为色曲、酒曲和功能性红曲。在红曲霉的发酵过程中,同时与红曲色素相伴产生一种有害的次级代谢产物一桔霉素。研究表明桔霉素具有肾毒性,可致畸、致癌和诱发基因突变。桔霉素的存在,制约了红曲在食品及药品方面的广泛应用,在一定程度上阻碍了红曲产业的发展。为此,在红曲生产中如何快速准确检测桔霉素以及有效地防控桔霉素,是我们当前迫切需要解决的问题。本文对近年来国内外红曲中桔霉素的检测方法及控制策略进展进行了综述。目前,桔霉素的检测方法主要有抑菌圈法、TLC法、酶联免疫法和HPLC法等,其中HPLC法是检测红曲中桔霉素高效且应用最广泛的方法。桔霉素的控制主要从菌种选育,发酵工艺及产品后续处理等方面进行调控。目前尚没有成熟的控制策略全部去除桔霉素,只有采用低产桔霉素的菌种,适合的生产工艺及结合后续的物理或化学处理等综合措施,生产出符合桔霉素控制标准的高品质红曲产品。     

Simultaneous enrichment of deglycosylated ginsenosides and monacolin K in red ginseng by fermentation with Monascus pilosus

To improve its bioavailability and pharmacological effects in humans, red ginseng was fermented with a newly isolated fungus, Monascus pilosus KMU103. Most of the ginsenosides were converted to deglycosylated ginsenocides, such as Rh(1), Rh(2), and Rg(3). The total amount of ginsenosides Rh(1), Rh(2), and Rg(3) was 838.7 mg/kg in the red ginseng, and increased to 4,117 mg/kg after 50 L fermentation in 13% red ginseng and 2% glucose. In addition, the Monascus-fermented red ginseng contained 3,089 mg/kg of monacolin K, one of the metabolites produced by Monascus known to reduce cholesterol in the blood. This newly developed Monascus-fermented red ginseng should result in improved health effects, not only by biotransforming gisenosides to deglycosylated ones but also by creating additional bioactive compounds.     

Plasma glucose-lowering action of Hon-Chi in streptozotocin-induced diabetic rats.

Hon-Chi was used for anti-hyperglycemic activity screening in streptozotocin-induced diabetic rats (STZ-diabetic rats) in an attempt to develop new substances for handling diabetes. Mandarin Hon-Chi is red yeast rice fermented with Monascus pilous and Monascus purpureus. Single oral administration of Hon-Chi decreased plasma glucose in STZ-diabetic rats in a dose-dependent manner from 50 mg/kg to 350 mg/kg. Similar treatment with Hon-Chi also lowered the plasma glucose in normal rats as effectively as that produced in STZ-diabetic rats. In addition, oral administration of Hon-Chi at the highest dose (350 mg/kg) attenuated the elevation of plasma glucose induced by an intravenous glucose challenge test in normal rats. Moreover, mRNA levels of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) in liver from STZ-diabetic rats were reversed in a dose-dependent manner by the repeated oral treatment of Hon-Chi three times daily for two weeks. Otherwise, hyperphagia in STZ-diabetic rats was markedly reversed by similar repeated treatment of Hon-Chi. The obtained results suggest that oral administration of Hon-Chi could decrease hepatic gluconeogenesis to lower plasma glucose in diabetic rats lacking insulin.     

红曲色素的两种新结构

从中国科学院微生物研究所保藏红曲菌中,筛选得到一株高产红色素的红曲菌菌株(AS.3.4617)。经鉴定属于红色红曲菌(Monascus anka Sato).通过有机溶剂的萃取和两次硅胶柱层析,从该菌株中分离得到两种色素样品,高压液相色谱测定为纯色素样品。通过元素组成分析,核磁共振谱,快离子轰击,质谱和高分辨质谱分析确定,这两种色素与已知的六种红曲菌色素不同,为新发现的红曲菌色素,它们可能的分子式为:C_(25)H_(31)O_5N和C_(23)H_(27)O_5N。     

一株高产Monacolin K紫红曲霉菌株筛选、鉴定及发酵条件优化

为从天然发酵红曲米中分离的30株红曲霉菌株中筛选高产MonacolinK的菌株,并对其产MonacolinK的发酵条件进行优化。实验采用高效液相色谱法(HPLC)筛选到9株具有产MonacolinK能力的红曲霉菌株,其中以编号ZX26的菌株产MonacolinK能力最高,发酵液中Monacolin K产量达到107.6mg/L,并且产MonacolinK能力具有良好的稳定性。微生物形态学结合ITS基因同源性分析结果表明,编号ZX26菌株为紫红曲霉。进一步采用单因素试验和正交试验法优化紫红曲霉ZX26产MonacolinK的发酵条件,结果表明在培养基组分为葡萄糖70g/L,牛肉膏15g/L,NaNO32g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO41.5g/L时,其最优发酵条件为:发酵初始pH4.0,接种量为7%,培养温度30℃,发酵10天,在此条件下,紫红曲霉ZX26发酵液中MonacolinK产量达到271.36mg/L,相对于培养条件优化前MonacolinK产量提高152.19%,经验证此培养条件下MonacolinK产量最佳。     

Statistical analysis and validation of process parameters influencing lovastatin production by Monascus purpureus MTCC 369 under solid-state fermentation

Monascus, a fermented rice (red mold rice), was found to reduce total cholesterol and triglyceride in serum due to the presence of lovastatin, a 3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitor. Optimization and validation of different process parameters such as temperature, fermentation time, inoculum volume, and pH of the solid medium was done using Box-Behnken’s factorial design of response surface method for maximum production of lovastatin by Monascus purpureus MTCC 369. A maximum lovastatin production of 3.422 mg/g was predicted by day 14.43 of fermentation in a rice based solid medium of pH 6 when fermented at a temperature of 29.46°C, an inoculum volume of 5.11 mL, and using response surface plots and the point prediction tool of Design Expert 7.1.3 (Statease Inc., USA) software.     

高产Monacolin K红曲菌株的复合诱变选育

利用紫外线和氯化锂对一株紫红曲Monascus purpureus菌株进行复合诱变试验。在最佳紫外照射时间为45s和最佳氯化锂浓度为1.0‰的情况下,获得了一株MonacolinK高产突变菌株Monascus purpureus ZT32且连续传接5代产量稳定,用紫外分光光度法检测其MonacolinK的含量为219.9μg/mL,较原始菌株高出2倍多,然后将其用于固态发酵,结果表明:红曲米中的MonacolinK的含量达到8.33mg/g,是原始菌株的3.3倍。     

A combined solid-state and submerged cultivation integrated with adsorptive product extraction for production of Monascus red pigments

A process taking advantages of combined solid-state and submerged cultivation of Monascus for red pigment production and integration of a product removal unit was developed. The solid-state cultivation was carried out in a 5 l fermentor, with rice being used not only as the substrate but also the support for Monascus. The inclusion of rice submergence and integration of product separation were achieved by intermittently rinsing the rice with monosodium glutamate (MSG) solutions every 12 h followed by an adsorptive extraction of the red pigment dissolved in the rinsing solution. With this new process, the Monascus red pigment production was increased by 24% as compared with that by the plain fixed-bed cultivation.     

荧光物质(MFA、MFB)的分离、结构鉴定及金华地区高产菌株的筛选

采用硅胶柱层析及制备型液相色谱仪对红曲米中两种荧光物质进行分离纯化,使用高效液相色谱法(HPLC)检测荧光物质纯度,然后使用高分辨质谱(ESI-HRMS)对两种荧光物质进行分析,得到两种荧光物质的分子量分别为356和384,ESI-MS/MS二级质谱把两者鉴定为monasfluore A (MFA)和monasfluore B (MFB);从金华地区红曲米中分离得到10株红曲菌株,经固态发酵采用HPLC法分析,筛选获得1株高产MFA、MFB的菌株WZWZ,该菌株发酵制得红曲米中MFA含量为3.63 g/kg,MFB含量为7.29 g/kg,对WZWZ菌株进行外观形态学及显微观察、ITS基因序列测定与分析,最终将菌株WZWZ鉴定为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。     

乙酸钠、烟酸对红曲菌白色变种产Monacolin K的影响

【背景】红曲是由红曲菌寄生在大米发酵而成的一种食用米曲,含有胆固醇抑制剂Monacolin K,但市售红曲中酸式Monacolin K含量低且普遍呈红色,其应用存在局限性。红曲菌白色变种3001-18具有不产色素和桔霉素而高产酸式Monacolin K的优点。【目的】研究微量营养物对红曲菌固态发酵Monacolin K产量及酸式结构占比的作用,并分析其对相关基因表达的影响。【方法】将不同微量营养物添加到固态发酵培养基中以提高红曲菌生物量、Monacolin K产量及酸式结构的含量,并对Monacolin K合成相关基因进行分析。【结果】添加质量分数为0.1%的乙酸钠后红曲Monacolin K总产量提高10.63%,可达17.90 mg/g;添加0.015%的烟酸后可以使红曲产品中MonacolinK酸式结构的比例由76.08%提升至90.51%;乙酸钠能促进MonacolinK合成相关基因mokA、mokB和mokC的表达,提高Monacolin K产量;烟酸则通过上调mokF、mokH和mokI的表达,使酸式Monacolin K迅速合成并外排且产物Monacolin K中酸式结构占比提升。【结论】微量营养物能通过增加红曲菌Monacolin K合成相关基因的表达量来促进其合成,为高产酸式Monacolin K的研究提供了一定的理论依据。