红曲霉T-DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选*

以农杆菌介导法建立的红曲霉T-DNA转化库为实验材料,采用抑菌圈法从5,000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株,用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子,其红曲中桔霉素含量介于0·04~154·57μg/g之间。进一步分析了突变子的红曲色价,发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。     

高产莫纳可林K低产桔霉素红曲霉菌株的筛选和发酵条件初步优化

采集全国各地红曲霉制品中的红曲霉资源,经分离获278株红曲霉菌株。高效液相色谱(HPLC)法测定各菌株发酵液中莫纳可林K(Monacolin K)和桔霉素含量,筛选获1株Monacolin K产量较高、桔霉素含量较低的红曲霉菌株编号为M-22。依据形态特征和ITS基因序列,参照红曲霉属分类检索表,鉴定M-22菌株为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。通过摇瓶发酵对温度、初始pH、碳源、氮源、碳氮比(C/N)等因素进行优化,确定M-22菌株摇瓶发酵产Monacolin K适宜条件为发酵温度26℃、初始pH 5.0、转速160 r/min,甘油为碳源、蛋白胨为氮源、碳氮比(C/N)为5:1,Monacolin K产量显著提高,最高为107.16 mg/L。以优化的发酵条件对M-22菌株进行5 L发酵罐发酵,发酵液中Monacolin K产量最高为189.83 mg/L,桔霉素含量32.53μg/L,红曲色素色价为16.38 U/m L。     

红曲霉T-DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选

以农杆菌介导法建立的红曲霉T—DNA转化库为实验材料,采用抑菌圈法从5,000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株,用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子,其红曲中桔霉素含量介于0．04～154．57μg／g之间。进一步分析了突变子的红曲色价,发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。     

红曲菌转化库中部分突变子的次级代谢产物分析

本文采用TLC、HPLC、ELISA等方法测定了12株红曲转化子MonacolinK、γ-氨基丁酸和桔霉素的含量。结果表明,与出发菌株P-4相比,突变株产次级代谢产物的能力都发生了不同程度的变化。8株突变菌株红曲的MonacolinK含量高于P-4,其中1121#的MonacolinK含量约为P-4的10倍,分别为542.13μg/g和58.65μg/g;GABA含量方面,以779#制备的红曲GABA含量最高,达1.165g/Kg,约为P-4的3倍;由167#制备的红曲的桔霉素含量最高,为65.71ng/g,而2107#与779#制备的红曲的桔霉素含量在实验条件下未检测到。     

农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的构建及色素突变子的性质分析

以农杆菌EHA105为介导,将带有潮霉素抗性基因和gus基因的T-DNA片段转化到红色红曲菌(Monascusruber)中。通过转化条件的优化,成功构建了含有5132个转化子的T-DNA插入突变库。根据菌落颜色与色素分泌情况筛选到50株色素突变子,聚合酶链式反应(PCR)表明上述突变子均有T-DNA片段插入。经5代的继代培养后,94%的突变子具有稳定性(潮霉素抗性)。对突变子产色素和桔霉素能力的分析表明其分泌次生代谢产物的能力发生了较大变化。本方法的建立,为进一步深入研究红曲菌的代谢调节和基因功能奠定了基础。     

生物合成γ-氨基丁酸曲霉菌株的选育、紫外诱变和发酵条件的研究

从自然发酵的红曲中分离筛选到1株曲霉菌株,其菌丝体可以谷氨酸钠为底物转化富集γ-氨基丁酸(GABA),经初步鉴定该菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)。以该菌株的孢子为对象进行紫外诱变,初筛得到8株产GABA活力不同的菌株,复筛后获1株GABA的产量较高的突变菌株As-8。菌株As-8转化富集GABA的适宜条件为:pH 6.0,以蔗糖为碳源,蛋白胨为唯一氮源或蛋白胨和牛肉膏为复合氮源。产生的GABA含量最高可达4.2g/L,并能稳定遗传。     

一株高产Monacolin K紫红曲霉菌株筛选、鉴定及发酵条件优化

为从天然发酵红曲米中分离的30株红曲霉菌株中筛选高产MonacolinK的菌株,并对其产MonacolinK的发酵条件进行优化。实验采用高效液相色谱法(HPLC)筛选到9株具有产MonacolinK能力的红曲霉菌株,其中以编号ZX26的菌株产MonacolinK能力最高,发酵液中Monacolin K产量达到107.6mg/L,并且产MonacolinK能力具有良好的稳定性。微生物形态学结合ITS基因同源性分析结果表明,编号ZX26菌株为紫红曲霉。进一步采用单因素试验和正交试验法优化紫红曲霉ZX26产MonacolinK的发酵条件,结果表明在培养基组分为葡萄糖70g/L,牛肉膏15g/L,NaNO32g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO41.5g/L时,其最优发酵条件为:发酵初始pH4.0,接种量为7%,培养温度30℃,发酵10天,在此条件下,紫红曲霉ZX26发酵液中MonacolinK产量达到271.36mg/L,相对于培养条件优化前MonacolinK产量提高152.19%,经验证此培养条件下MonacolinK产量最佳。     

红曲霉桔霉素的检测方法及红曲霉产桔霉素的判别方法*

建立了红曲霉真菌毒素桔霉素的HPLC检测方法。用谷氨酸和葡萄糖为唯一氮、碳源的培养基(MSG)液态摇瓶培养及红曲米固态培养,对30多株红曲霉产桔霉素的情况进行了普查,发现大多数红曲霉菌种可产生桔霉素。红曲霉的培养状态及条件对桔霉素的产生有重大影响。红曲霉菌种是否产桔霉素,可根据MSG培养基摇瓶发酵液中是否含有桔霉素来初步定性判断,为准确判断红曲霉菌是否产桔霉素,可采用多种培养法综合判断。     

农杆菌介导的紫色红曲霉遗传转化体系的建立和优化

通过优化各种转化因素,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导红曲霉(Monascus)的高效转化体系:红曲霉在PDA培养基培养21 d后收集孢子,制备红曲霉孢子悬浮液,浓度为106个/mL,根癌农杆菌浓度为OD600值0.5,诱导剂AS浓度为100μmol/L,农杆菌与红曲霉在25℃共培养3 d。采用此转化体系构建了含有530多个转化子的红曲霉T-DNA插入突变体库。随机选取50株转化子菌株进行分子验证和稳定性检测,证明T-DNA成功插入红曲霉基因组DNA中,并能稳定遗传。最后,通过形态观察筛选出8株变异较大的菌株,为以后的红曲霉基因功能研究奠定了一定的基础。     

低能离子注入诱变选育高产虾青素红法夫酵母突变株

红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是发酵法生产虾青素的优良菌株。采用低能氩离子注入、紫外线复合诱变处理,选育到一株高产虾青素的红法夫酵母突变株G993。在优化条件下,该菌株摇瓶发酵的生物量、虾青素产量和虾青素含量分别为17.15 g/L、13 206μg/L和770.0μg/g干菌体,较出发菌株分别提高45.34%、271.5%和155.6%。在1吨发酵罐放大实验中,该菌株生物量为26.04 g/L,虾青素产量达到20 041μg/L。菌株经过八次传代培养,虾青素产量下降率小于等于1.35%,是一株性状较稳定、可深入开发研究的优良菌株。     

吸水链霉菌井冈变种的色素合成基因缺失对井冈霉素产量的影响北大核心CSCD

【目的】通过缺失井冈霉素高产菌株TL01中4个典型的色素合成基因簇来考察其对井冈霉素产量、菌体生长和发酵液颜色的影响。【方法】通过同源重组双交换对4个色素合成基因簇进行逐个同框缺失,HPLC检测突变株井冈霉素产量的变化,q RT-PCR检测突变株中井冈霉素合成基因转录变化,通过称量菌丝体干重来绘制其生长曲线。【结果】和出发菌株TL01相比,多巴类黑色素基因簇缺失株PY06中井冈霉素的发酵产量由原来的20.6 g/L上升至23.1 g/L,提高了12%;III型聚酮合酶编码的黑色素基因簇缺失株PY07产量无明显变化;II型聚酮合酶编码的孢子色素基因簇缺失和褐黄素基因簇缺失分别导致井冈霉素产量下降11.7%和17.2%。所有缺失突变株中井冈霉素基因簇转录水平和发酵液颜色均没有明显变化。【结论】不同色素基因的缺失对井冈霉素产量和菌株生物量积累具有不同的影响。多巴类黑色素与井冈霉素的生物合成过程竞争共同前体,将其中断后使前体流向井冈霉素生物合成,达到了进一步提高产量的目的。     

1株产生洛伐他汀杂色曲霉的筛选、鉴定和发酵优化条件

从不同生境收集的自然发酵样品中分离纯化获86株曲霉纯菌株;用薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)测定曲霉各菌株发酵液中洛伐他汀(Lovastatin)含量进行筛选;获1株较高产Lovastatin的编号为A-8曲霉菌株,产量为58 g/L。根据形态特征和ITS基因序列,鉴定A-8菌株为杂色曲霉。单因素实验初步优化了A-8曲霉菌株发酵条件和培养基配方,结果表明A-8菌株产生Lovastatin较适宜的发酵条件为:温度28℃、初始pH 5.2、摇床转速180 r/min、接种量为10%;培养基配方为:乳糖为碳源、含量为100 g/L,蛋白胨为氮源、含量为12 g/L,碳源/氮源为15∶1.5;在该条件下A-8曲霉菌株发酵产生Lovastatin的水平最高,可达130.04μg/mL,比优化前提高了约2.24倍。A-8曲霉菌株是较有潜力的工业菌株。     

红曲霉T-DNA插入突变库中色素突变子的筛选

红曲霉（Monascus purpureus）是我国重要的传统食用和药用微生物,能分泌红曲色素、莫纳卡琳（Mo-nacolin K）、γ-氨基丁酸、麦角固醇等物质,被广泛用于生产食品发酵剂、食品着色剂、保健食品和药品等,在我国有上千年的应用历史。本实验以根癌农杆菌（Agrobacterriumtum efaciens）介导的红曲霉突变体库中754株突变子菌株为材料,通过乙醇提取法筛选出了9株产红曲色素发生显著变化的色素突变子,其中S50在505 nm波长处的色价降为原始菌株S的0.12倍,几乎变为白化株。300~600 nm波长下UV-VIS扫描图谱特征显示,色素突变子不仅色价发生了变化,而且吸收波长、吸收峰值也发生了不同程度的变化。最后,对色素突变子菌落形态、显微结构、潮霉素抗性、遗传稳定性以及产桔霉素能力等进行分析,为研究红曲霉产色素相关基因奠定了基础。     

高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7诱变株的筛选

【目的】对野生菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变育种,筛选高产DHA突变株。【方法】采用UV诱变和化学药物胁迫筛选方式,以菌株的生物量、油脂产量、DHA产量作为筛选指标,获得高产DHA突变株。【结果】经鉴定获得一株DHA高产突变株PKU#PM003,该菌株传代4次后仍保持较好的遗传稳定性。摇瓶发酵后,PKU#PM003生物量产量高达6.62 g/L,比原始菌株5.95 g/L提高了11.26%,脂肪酸含量高达4.01 g/L,比原始菌株3.18 g/L提高了26.1%,DHA在脂肪酸中所占比例由29.97%增加到33.43%,产量提高了41.01%,油脂突变效果显著。【结论】突变株PKU#PM003可作为性状优良的工业化发酵生产菌种,并在DHA产量提升上仍具有巨大的空间。     

农杆菌介导转化黑曲霉分生孢子及产孢缺陷突变子T-DNA插入位点分析

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA系统,建立转化黑曲霉(Aspergillus niger)分生孢子的方法,构建T-DNA插入突变子文库,为黑曲霉基因组功能注释研究打下基础。【方法】采用携带二元质粒载体pCAMBIA1301的农杆菌EHA105,诱导转化黑曲霉分生孢子,筛选具有潮霉素抗性的突变子。分析抗性稳定突变子菌株的表型,采用反向PCR方法分析T-DNA插入位点相邻位置的序列,并推测突变基因可能具有的功能。【结果】实验获得具有稳定潮霉素抗性转化子193株,转化率为5.6×102转化子/108分生孢子。部分转化子表型出现较为明显改变,其中一株不能产孢,对其T-DNA插入位点序列分析比对结果显示,突变基因属于超级转运家族(major facilitator superfamily,MFS)。【结论】本研究建立的农杆菌转化黑曲霉分生孢子平台,结合T-DNA插入突变位点分析,可以为黑曲霉基因组功能注释研究提供一种简便有效的途径。     

农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株

建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法及T-DNA突变库,高效筛选聚苹果酸高产菌株及功能基因。通过含潮霉素和草铵磷抗性基因的农杆菌转化出芽短梗霉,抗性压力筛选及PCR验证建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法,结合发酵液p H与聚苹果酸含量响应变化,微孔板高效筛选高产聚苹果酸的T-DNA插入突变株,基因组步移确定T-DNA插入位点及功能基因。结果获得遗传稳定的抗性基因菌株,每107个细胞可获得80-120个转化子,出芽短梗霉H27号T-DNA突变株聚苹果酸摇瓶发酵产量提高24.5%,基因组步移证实糖酵解途径磷酸甘油酸变位酶基因被破坏。成功建立了根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法和T-DNA插入突变库,结合高效筛选方法为聚苹果酸合成功能基因挖掘及高产机制解析奠定基础。     

高产Monacolin K纯种红曲培养条件的研究

本实验对已有的十株红曲霉菌株进行纯种制曲,筛选出一株生长良好、Monacolin K含量高、不产桔霉素、产色素能力强及糖化酶活力相对较高的红曲霉菌株.以大米为原材料,采用液固联合制曲法,通过单因素实验对纯种红曲的培养条件进行优化.结果表明,固体培养基初始含水量为45％,接种量为8％,变温培养红曲时,红曲霉M-7所得纯种红曲最佳,其Monacolin K含量高达243 μg/g,色价450 U/g,糖化酶活力4 289 U/g.与优化之前比较,Monacolin K含量提高了37.2％.     

黑曲霉纤维素酶突变子T-DNA插入位点的遗传分析及性质鉴定

采用羧甲基纤维素钠筛选培养基,对黑曲霉(Aspergillus niger)T-DNA突变子文库进行筛选,分离到一株纤维素酶分泌水平较低的菌株AN-108,为野生型菌株的83.3%。进一步测定该突变子固体发酵的纤维素酶活力,与野生型菌株相比没有明显差别,推测与固体发酵培养基中含有的天然糖类有关。在添加不同糖类的CMC-Na平板上培养该突变子,菌落周围均出现较明显的水解圈,结果显示糖类可能作为诱导物克服突变带来的影响。为了确定突变子AN-108中何种基因被阻断,采用反向PCR方法分析了T-DNA插入位点的序列,获得序列经过比对分析发现,该序列与黑曲霉An14g03730同源程度达90%,编码富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein,PRP)。     

高产洛伐他汀棒曲霉菌株的筛选、鉴定及发酵条件优化

从不同生境(食品、土壤、空气、有机质等)收集到的自然发酵样品中分离得到150株曲霉属菌株.用高效液相色谱(HPLC)法检测发酵液中洛伐他汀(Lovastatin)含量,筛选获得1株稳定高产Lovastatin的曲霉菌株(编号:Ac-32).根据菌落形态特征并结合18 S rDNA测序,鉴定其为棒曲霉(Aspergillus clavatus).通过摇瓶发酵单因素实验优化了碳氮源种类、碳氮源含量、碳氮比(C/N)、发酵温度、初始pH、转速、种龄和接种量,确定了棒曲霉菌株Ac-32摇瓶发酵产Lovastatin的适宜条件为:乳糖为碳源、蛋白胨为氮源、碳源含量为100 g/L、氮源含量为12 g/L、碳氮比(C/N)为15:1.8、温度28℃、转速180 r/min、初始pH 5.2、种龄4 d、接种量6%.采用Minitab 17软件的P-B实验设计法,筛选对Lovastatin产量有显著影响的因素为:温度、pH、碳源含量和氮源含量.根据P-B实验结果,运用响应面法分析,确定棒曲霉菌株Ac-32产Lovastatin的最优条件为:碳源含量100 g/L,氮源含量11.8 g/L,温度28℃,pH 5.2.在此条件下,Lovastatin最高产量为236.221μg/mL.     

烟曲霉突变体库的构建及伊曲康唑耐药菌的筛选

目的构建烟曲霉突变体库并筛选耐药突变子,初步探讨烟曲霉的耐药机制。方法利用根瘤农杆菌T-DNA介导的插入突变构建烟曲霉突变体库,用伊曲康唑对突变体库进行筛选,挑取烟曲霉耐药突变株。结果利用根瘤农杆菌T-DNA插入突变,本研究获得了1805株突变子,诊断PCR显示突变子基因组DNA上均含有潮霉素标记,说明T-DNA均插入到了宿主的基因组上。通过筛选,本研究成功获得了16株烟曲霉伊曲康唑耐药菌,其中有两株对两性霉素B表现为不同程度的耐药性。结论通过构建烟曲霉突变体库以及耐药突变子筛选获得了16株烟曲霉耐药菌,为进一步研究烟曲霉的耐药机制奠定了基础。