短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,得到重组质粒pHBM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达。将重组毕赤酵母KM71(pHBM220)、GS115(pHBM220)、SMD1168(pHBM220)分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃。在其最适反应条件下测得三者粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL。重组毕赤酵母KM71(pHBM220)所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三者没有太大的差异。     

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酶母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,得到重组质粒pH-BM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达,将重组毕赤酵母KM71（pHBM220）,GS115（pHBM220),GS115(pHBM220),SMD1168（pHBM220）分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃,在其最适反应条件下测得三粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL,重组毕赤酵母KM71（pHBM220）所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三没有太大的差异。     

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。     

金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究

综合运用cDNA末端快速扩增 (RapidAmplificationofcDNAEnds ,RACE )和基因组步行等技术克隆到一个金针菇 (Flammulinavelutipes)的漆酶结构基因和其对应的全长cDNA ,经测序和BLAST比对分析表明该基因属于多铜氧化酶基因家族 ,与已发表的漆酶基因 (AF176 2 30 )的同源性最高 ,在氨基酸水平为 72 %。该结构基因命名为gl ccFv,cDNA命名为lccFv ,其序列提交GenBank ,登录号分别为AY4 85 82 6和AY4 5 0 4 0 6。将lccFv的开放阅读框克隆到毕赤酵母表达载体pHBM90 6 ,转化毕赤酵母GS115且实现了分泌表达。将重组毕赤酵母GS115 (pHBM5 6 5 )诱导产酶 ,在培养温度 2 0℃、甲醇流加量为 1 0 % (V V)的情况下 ,其分泌表达的LCCFv的最高酶活为 0 10 70U mL ,最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH值为 3 9,在最适反应条件下其热稳定性和pH值稳定性均较好     

酸性木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

运用“鸟枪法”克隆构建了环境微生物的基因组文库,并从中筛选得到一个酸性木聚糖酶基因,命名为xyl3,其在GenBank中的登录号为gb：AY300805。BLAST分析表明,该基因的序列同源性很低,其中仅存在很短的木聚糖酶基因的同源片段,其编码的木聚糖酶属于Glycosyl hydrolases family 10,与来源于Geobacillus stearothermophilus的intra—cellular xylanase在氨基酸水平具77％同源性。该基因经T4 DNA polymerase处理后,克隆至经限制性内切酶CpoⅠ和NotⅠ双酶切后的毕赤酵母表达载体pHBM905,获得重组质粒pHBM706。此重组质粒转化毕赤酵母GS115,经含有交联木聚糖的选择性培养平板和PCR扩增鉴定筛选得到重组毕赤酵母GS115（pHBM706）。以0．5％甲醇于28℃诱导产酶,测得重组毕赤酵母GS115（pHBM706）在诱导的第36h产酶达最高值,所产粗酶液酶活为0．177IU／mL。该酶的最适反应pH为5．5,最适反应温度为50℃。     

灰盖鬼伞过氧化物酶功能表达及部分酶学特性

摘要:【目的】旨在用毕赤酵母高效表达灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】借助DNAworks 3.1软件设计、优化引物,用自己构建的基因合成、定点突变平台合成了毕赤酵母密码子偏好性的灰盖鬼伞过氧化物酶基因,测序后构建在表达载体pPICZαA上,整合于巴斯德毕赤酵母GS115染色体,来自酿酒酵母的α因子作为信号肽序列指导重组蛋白的分泌表达。从82个PCR检测为阳性的酵母转化子中筛选出6株高Zeocin抗性的菌进行表达,选表达酶活性最高的作为实验菌株命名为CIP/GS115。【结果】以ABTS为底物时,CIP/GS115 在甲醇诱导第4天酶活最高达到487.5 U/mL,是目前摇瓶培养诱导表达灰盖鬼伞过氧化物酶活性最高报道。纯化后的酶最适反应温度为25℃,45℃酶反应速度是最适温度时的61.5%,在低于40℃时比较稳定,超过45℃稳定性迅速下降。最适反应pH 为5.0,在pH 4.5－6.5之间比较稳定。以不同的底物研究纯酶底物特异性发现最适底物的顺序是:ABTS ＞ 愈创木酚＞ 2,6-二甲氧苯酚＞ 2,4-二氯苯酚＞ 苯酚。【结论】灰盖鬼伞过氧化物酶在毕赤酵母中的高效分泌表达和高的特殊活性为该酶在废水处理、染料脱色等方面的工业化应用奠定了一定基础。     

短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的胞外表达及重组漆酶酶学性质研究

为了获得表达量高、稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶,通过PCR扩增出短小芽孢杆菌LC01的漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac,转化毕赤酵母菌株SMD1168H后利用甲醇诱导培养重组菌获得重组漆酶,纯化并分析了重组漆酶的性质。重组菌株产漆酶活性在第7天达到最高,为1 390 U/L。纯化的重组漆酶分子量为65 kD,以丁香醛连氮为底物的最适反应温度和pH分别为70℃和6.8。在pH 9.0放置10 d活性没有下降,在70℃保温10 h后仍保留36%的酶活。Al~(3+)、Fe~(3+)和Mn~(2+)完全抑制漆酶活性。在介体乙酰丁香酮参与下该漆酶能够有效脱色RB亮蓝、活性黑5和靛红,在pH 9.0时6 h的脱色率达到了90%以上,表明该重组漆酶能有效应用于染料废水的脱色处理。     

嗜热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质

木聚糖酶Umxyn10A,属于GH10家族,包含一段跨膜区和GH10家族催化功能域,将跨膜区去掉后,剩余部分重命名为Umxyn10AQ。按毕赤酵母密码子偏好性将Umxyn10AQ序列进行密码子优化,与毕赤酵母表达载体p PIC9K相连。重组质粒p PIC9K-Umxyn10AQ经SalⅠ单酶切线性化后转至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组毕赤酵母菌株GS115/Umxyn10AQ,每12 h添加1%甲醇诱导剂。DNS法测定重组木聚糖酶re Umxyn10AQ酶活,最高酶活达到15 U/m L,SDS-PAGE分析表明,re Umxyn10AQ相对分子质量为45.0 k D。重组木聚糖酶re Umxyn10AQ的最适p H为8.0,最适反应温度85℃,Co2+对该酶活有显著促进作用,提高了近20%,水解产物为木糖(14%)、木二糖(86%)。结果表明,木聚糖酶Umxyn10AQ在毕赤酵母中成功表达并且分泌到胞外,相较于大肠杆菌表达产物Umxyn10A,最适p H提高了1.5个单位、最适温度提高了10个单位,p H耐受性和温度耐受性都有所改善,并且主要水解产物仍为木二糖。     

马铃薯α-淀粉酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其酶学性质的研究

采用RT-PCR法扩增马铃薯夏波蒂的α-淀粉酶成熟肽基因,将其亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9k上,SacII线性化重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,构建重组酵母GS115/pPIC9k-amy,利用锥虫蓝法筛选获得高活性转化子(GSamyA5),以终浓度为0.5%甲醇诱导该重组菌表达α-淀粉酶,通过Ni~(2+)-NTA agarose亲和层析纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明:该酶的最适反应温度为45℃,40~50℃酶活较稳定,保温50 min,残留相对活力达92.6%;最适反应pH值为6.0,并在pH 6.0~7.0范围内酶活保持稳定。Ca~(2+)、K~+可促进酶反应,以Ca~(2+)影响为最,相对酶活力提高到125%;Cu~(2+),Fe~(2+),Fe~(2+),Zn~(2+)对该酶有显著抑制作用;Mn~(2+),Mg~(2+)对酶有微弱抑制作用,Li~+、Na~+对酶活影响不大。     

植酸酶和甘露聚糖酶双功能毕赤酵母工程菌的构建和产酶分析

根据已发表的植酸酶基因和甘露聚糖酶基因序列设计并合成引物,应用PCR技术,分别以土曲霉总DNA和质粒pHBM1201为模板,扩增出均不含假定信号肽序列的植酸酶基因phyA和甘露聚糖酶基因man,将它们各自克隆到毕赤酵母表达载体pHBM907C上,分别得到重组质粒pHBM907C-phyA和pHBM907C-man。将质粒pHBM907C-phyA上由乙醇氧化酶(AOX1)启动子和终止子引导表达、酿酒酵母α信号肽序列引导分泌的phyA表达盒式结构插入到质粒pHBM907C-man中,构成双基因表达分泌质粒pHBM907C-phyA-man。pHBM907C-phyA-man经SalⅠ酶切线性后转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,获得了同时分泌表达植酸酶和甘露聚糖酶的双功能酵母工程菌。研究了该酵母工程菌所分泌表达的重组植酸酶和甘露聚糖酶的相关酶学性质,并进行了双功能酵母工程菌的稳定性测试。     

重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达

【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rt PA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以p PIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rt PA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒p ET28a-rt PA为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的基因rt PA,插入分泌型表达载体p PIC9K中,获得重组表达质粒p PIC9K-rt PA。重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后,电击转化至3种不同表型的P.pastoris(GS115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达;重组表达体系进行甲醇诱导表达,对产物进行Western blot鉴定,并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性。【结果】重组蛋白分子量约为43 k D;rt PA-GS115和rt PA-KM71均在39 k D处有特异性条带,且前者在32 k D处有轻微降解条带,而后者并无此现象;rt PA-SMD1168无降解现象,且rt PA-SMD1168比活性较rt PA-GS115高27%;rt PA-KM71表达量和活性均为最低。【结论】从重组蛋白生物活性出发,P.pastoris SD1168可作为rt PA的最佳表达体系,在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下,P.pastoris GS115也是rt PA表达的优选体系。     

碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。前期研究工作已经将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中成功表达。本研究为了提高其表达量,首先利用启动子和信号肽都优化的载体pHBM905BDM进行表达,摇瓶酶活从68 U/mL增加到100 U/mL,qPCR检测转录水平提高了27%。再利用果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵获得菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,摇瓶酶活为536 U/mL。随后构建重组质粒pPIC9K-pels,电转化菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,利用抗生素G418平板进行筛选,在含4 mg/mL的G418抗性平板上得到菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1,摇瓶酶活为770 U/mL,qPCR测定含7个拷贝目的基因。最后将该菌株在5 L的发酵罐中进行高密度发酵,果胶酶酶活提高至2 271 U/mL。该碱性果胶酶酶活已达到目前酵母表达的最高水平,说明其具有很好的应用于纺织工业的潜力。     

High-level expression of recombinant phospholipase C from Bacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization

The phospholipase c (plc) gene from Bacillus cereus was cloned into the pPICZC vector and integrated into the genome of Pichia pastoris. The phospholipase C (PLC) when expressed in P. pastoris was fused to the alpha-factor secretion signal peptide of Saccharomyces cerevisiae and secreted into a culture medium. Recombinant P. pastoris X-33 had a clear PLC band at 28.5 kDa and produced an extracellular PLC with an activity of 678 U mg(-1) protein which was more than a recombinant P. pastoris GS115 (552 U mg(-1) protein) or KM71H (539 U mg(-1) protein). The PLCs were purified using a HiTrap affinity column with a specific activity of 1335 U mg(-1) protein by P. pastoris GS115, 1176 U mg(-1) protein by P. pastoris KM71H and 1522 U mg(-1) protein by P. pastoris X-33. The three recombinant PLCs had high PLC activity in the low pH range of 4-5 and higher thermal stability (e.g. stable at 75 degrees C) than the wild-type PLC from B. cereus . Some organic solvents, surfactants and metal ions, e.g. methanol, acetone, Co(2+) and Mn(2+) etc., also influenced the activity of the recombinant PLCs.     

Fermentation strategies for improved heterologous expression of laccase in Pichia pastoris

Improved expression of recombinant laccase by Pichia pastoris carrying the lcc1 cDNA isolated from Trametes versicolor was achieved by optimization of the cultivation conditions in a fermentor equipped with a methanol sensor system. The results indicated that the activity obtained in fermentor cultivations was at least 7 times higher than in shake-flask cultures. Three different strategies for fermentor cultivations were compared: A (30 degrees C, 1.0% methanol), B (20 degrees C, 1.0% methanol), and C (20 degrees C, 0.5% methanol). The laccase activity, particularly the specific activity, could be improved by decreasing the cultivation temperature. The mechanisms behind the temperature effect on the laccase activity may be ascribed to poor stability, release of more proteases from dead cells, and folding problems at higher temperature. The results showed that the methanol concentration had a marked effect on the production of active heterologous laccase. A fivefold higher volumetric laccase activity was obtained when the methanol concentration was kept at 0.5% instead of 1.0%. The detrimental effect of methanol on the production of recombinant laccase may be attributed to lower laccase stability, a higher proteolytic activity, and folding problems due to higher growth rate at 1.0% methanol.     

用GAP启动子在Pichia pastoris GS115中组成型表达鼠灰链霉菌腺苷酸脱氨酶

【目的】构建产AMP脱氨酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)基因组为模板PCR扩增获得腺苷酸脱氨酶基因AMPD,以pGAP9K为载体构建重组表达质粒pGAP9K-AMPD并通过电转化法转入Pichia pastoris GS115,筛选转化子对其酶活进行测定,并初步优化其发酵条件。【结果】构建了毕赤酵母重组菌,通过分光光度法测定,显示重组菌有明显的酶活;初步优化发酵条件为:该重组菌最适发酵培养基为:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O0.05%,pH 6.0;发酵条件为:接种龄24 h,转接量3%,30°C﹑200 r/min培养96 h,取发酵上清液测定酶活,重组菌腺苷酸脱氨酶酶活达到2 230±60 U/mL。【结论】构建了一株产AMP脱氨酶活性较高的重组毕赤酵母菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到2 230±60 U/mL。为AMP脱氨酶工业化生产奠定了一定的基础。     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。