嗅鞘细胞对神经干细胞分化的影响

目的:探索体外嗅鞘细胞对神经干细胞分化的影响.方法:体外培养、纯化及鉴定神经干细胞和嗅鞘细胞.实验组采用嗅鞘细胞和神经干细胞采用共培养液培养;对照组采用神经干细胞单独培养.观察嗅鞘细胞对神经干细胞分化的影响.结果:共培养液培养4d后,实验组与对照组的分化情况没有差异.7d后,对照组神经干细胞分化为GFAP阳性细胞绝对数和百分比明显高于4d时(P＜0.05);实验组GFAP和CNPase的阳性细胞绝对数以及CNPase的百分比较4d时显著增加(P＜0.05),并高于对照组(P＜0.05).结论:共培养液培养促进神经干细胞向少突胶质细胞分化.     

乳鼠海马神经干细胞的体外分离、扩增和分化研究

探讨海马神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）在体外分离扩增和诱导分化的可行性。无菌条件下分离新生（24h）SD大鼠海马神经干细胞,采用无血清培养和胎牛血清诱导分化。免疫荧光染色技术分别检测诱导前细胞巢蛋白（Nestin）的表达,以及分化细胞的神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）、胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein,GFAP）的表达,以鉴定细胞类型。流式细胞仪检测神经干细胞分化前后增殖能力的变化。结果显示：从乳鼠海马分离培养的细胞生长状态良好,具有克隆增殖能力,并呈Nestin表达阳性,分化后可出现NSE及GFAP表达阳性的细胞。流式细胞仪检测显示：诱导前,细胞增殖活跃,S＋G2／M期细胞为（36．27±1．99）％,而分化各阶段（3,7,10d）S＋G2／M期细胞比例与诱导前（Ctrl）相比则明显下降（尸〈0．05）,分别为（26．39±1．10）％、（26．33±1．33）％和（24．54±1．12）％。这些结果表明乳鼠海马存在神经干细胞,并具有自我更新和多向分化的潜能,可用于基础和临床的相关研究。     

川芎嗪对体外培养的胎鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨川芎嗪（TMP）在体外神经干细胞（NSCs）增殖与分化中的作用。方法：原代提取孕14 d雌性大鼠的胎鼠大脑皮层分离培养,并作免疫荧光染色鉴定,取传代培养第3代的NSCs进行实验。实验分为对照组、β-巯基乙醇阳性对照组、TMP诱导组和TMP+EGTA组（n=4）。采用BrdU法和MTT法观察川芎嗪对NSCs增殖数量的影响,采用蛋白免疫印迹法检测NSCs的分化表达情况。结果：实验成功分离纯化原代NSCs,培养3~5 d可见部分神经球形成,具备典型的NSCs形态并表达NSCs特异抗原巢蛋白;BrdU法和MTT法结果均显示,与对照组和β-巯基乙醇阳性对照组相比,TMP组NSCs增殖数量明显增多（P<0.05）;蛋白免疫印迹结果显示,TMP组和TMP+EGTA组NSCs的神经元分化率明显增高,TMP+EGTA组分化率增高更明显（P<0.05）。结论：TMP能显著增强NSCs的增殖和神经元分化率。减少细胞外Ca²⁺可促进TMP诱导NSCs向神经元分化,Ca²⁺信号在TMP诱导NSCs向神经元分化过程中起重要作用。     

RCMV感染星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

探讨大鼠巨细胞病毒（rat cytomegalovirus,RCMV）感染大鼠星形胶质细胞后,对神经干细胞分化的影响。原代分离培养新生大鼠星形胶质细胞和胚胎海马神经干细胞,将星形胶质细胞感染RCMV后和神经干细胞在Transwell24孔共培养体系下进行共培养,同时设对照组;用免疫荧光染色等方法检测神经干细胞与感染RCMV的星形胶质细胞共培养后,其分化细胞中神经元微管相关蛋白（microtubule-associated protein 2,MAP2）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（glial fibril—lary acidic protein,GFAP）的表达。结果发现,感染RCMV的星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞分化减慢,分化成的神经元和星形胶质细胞比率低于对照组,提示星形胶质细胞感染RCMV后可抑制神经干细胞的分化,可能与RCMV影响星形胶质细胞合成和分泌各种营养因子,干扰了神经干细胞的分化进程有关。     

博尔纳病病毒核蛋白调控神经干细胞存活增殖及ERK1／2信号通路的实验研究

目的观察博尔纳病病毒核蛋白（Borna disease virus p40,BDV p40）对大鼠海马源性神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）增殖、存活、分化及ERK1／2信号通路的影响,揭示BDV引起神经精神疾病的部分发病机制。方法（1）分别用pEGFP—N1—p40及pEGFP—N1质粒转染NSCs,观察转染效率并鉴定BDVp40在NSCs中的表达。（2）实验设置3组：未转染组、pEGFP—N1空转对照组及pEGFP—N1—p40转染组,用CCK-8试剂盒、Brdu摄入实验及免疫组化分别检测细胞存活、增殖及分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的比例的变化,并经Western Blot检测ERK1／2磷酸化的改变。结果（1）成功建立表达BDVp40的NSCs模型;PCR结果显示只有pEGFP—N1-p40转染组细胞有BDVp40基因表达。（2）BDVp40抑制NSCs的存活、增殖,但对于转染后贴壁分化14d时3组细胞分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的比例未见显著差异。WesternBlot结果显示BDVp40下调了磷酸化ERK1／2在蛋白水平的表达。结论BDVp40抑制NSCs的存活、增殖,但是对NSCs的分化方向没有明显的影响。BDVp40有可能通过下调磷酸化ERK1／2活性对NSCs的存活、增殖起抑制作用。     

一氧化氮促进体外培养大鼠脑室下区神经干细胞的分化

目的：探讨一氧化氮（NO）对新生大鼠体外培养的神经干细胞（NSCs）分化的作用。方法：采用常规方法分离新生大鼠脑室下区（SVZ）组织,进行NSCs体外培养。用DETA／NO作为NO供体,用L-NAME作为一氧化氮合酶（NOS）抑制剂。免疫荧光法检测NSCs标志物-巢蛋白（nestin）、神经元标志物-8Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）和星型胶质细胞标志物-胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,还检测了神经元型NOS的表达。用Greiss还原法检测培养液中总NO的浓度。结果：培养的神经球均为nestin阳性、BIdu阳性和nNOS阳性。NSCs和40μmol／L、50μmol／L、60μmol／LDEFA／N0共培养5d,实验组培养液中N0浓度较对照组显著增高（P〈0．01）,相应实验组分化的神经元数和星型胶质细胞数较对照组明显增加（P〈0．01和P〈0．05）。NSCs和100μmol／L、150μmol／L、200μmol／LL-NAME共培养5d,实验组培养液中NO浓度较对照组降低（P〈0．05）,相应实验组分化的神经元数和星型胶质细胞数也较对照组减少（P〈0．05）。结论：NO能直接促进大鼠SVZ体外培养的NSCs分化。     

HCMV感染抑制人海马神经干细胞分化

研究HCMV感染对体外培养的人海马源性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)分化的影响。体外分离、培养人海马NSCs,应用免疫荧光方法检测其NSCs标记物-巢蛋白(Nestin)的表达。10%胎牛血清诱导NSCs贴壁分化,同时用MOI为5的HCMV AD169株感染NSCs,7d后使用激光共聚焦显微镜免疫荧光方法检测Nestin、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和HCMV即刻早期蛋白(IE)的表达,计算阳性细胞比率。本实验所培养的细胞(4～6代)95±8%表达Nestin;分化诱导7d后,感染组86±12%细胞表达IE,未感染组和感染组Nestin阳性率分别为50±19%和93±10%(t=6.03,P<0.01),GFAP阳性细胞率分别为81±11%和55±17%(t=3.77,P<0.01)。以上结果表明分化过程中的NSCs是HCMV的容许细胞;HCMV感染可以抑制NSCs的分化。     

L-型钙通道对大鼠胚胎海马神经干细胞增殖和分化的调控

为鉴定大鼠胚胎海马神经干细胞(NSCs)是否表达功能性的L-型钙通道,L-型钙通道是否参与了对大鼠胚胎NSCs增殖和分化调控.分离孕15天Wistar大鼠胚胎海马组织,制成单细胞悬液,利用无血清培养技术,在添加bFGF、EGF、N-2和B27 supplement的DMEM/F12培养液中进行培养.采用细胞免疫荧光法对原代至第5代细胞进行鉴定,均有巢蛋白(nestin)的表达,第3代nestin阳性细胞比例达97%.把培养的细胞诱导分化5天后,这些细胞表现为神经元和星形胶质细胞的形态,且分别呈Ⅲ型β-微管蛋白(Tuj1)阳性和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性;细胞免疫印迹结果显示,NSCs表达L-型钙通道的Cav1.2α1C亚单位,而无Cav1.3α1D亚单位的表达;利用全细胞膜片钳技术在NSCs上记录到了L-型钙电流,证明了NSCs所表达的L-型钙通道具有功能.进一步对细胞进行药理学干预,发现L-型钙通道的激活不仅可以促进胚胎NSCs的增殖,而且使增殖的NSCs向神经元分化的比例显著增加.以上结果表明,Wistar大鼠胚胎海马NSCs表达功能性的L-型钙通道;L-型钙通道参与了胚胎NSCs增殖和分化的调控.     

溶血磷脂酸对离体培养的大鼠胚胎神经干细胞向神经胶质细胞分化的影响

本研究用免疫细胞化学荧光双标技术观察了溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）对大鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells,NSCs）分化为少突胶质细胞（galactocerebroside—positive,Gal-C阳性）和星形胶质细胞（grim fibrillary acidic protein-positive,GFAP阳性）的影响,并且用RT-PCR技术对NSCs可能表达的LPA受体进行分析。结果显示：（1）加入不同浓度（0．010．0μmol／L）LPA,第7天进行检测时,少突胶质细胞数量呈明显的剂量依赖性增加,峰值出现在1．0μmol／LLPA组,少突胶质细胞所占百分比从对照组的8．5％增加到32．6％;（2）星形胶质细胞的分化几乎不受LPA的影响,第7天时各LPA处理组星形胶质细胞百分比与对照组相比均无显著性差异;（3）RT-PCR结果显示,大鼠胚胎NSCs的LPA1和LPA3受体表达明显,而LPA3受体表达很弱。以上结果表明,较低浓度的LPA可能作为细胞外信号,通过LPA1和LPA3受体促进大鼠胚胎NSCs向少突胶质细胞分化和生成,但对星形胶质细胞的分化过程无明显影响。     

GABA促进成年小鼠SVZ来源的神经干细胞增殖

通过Alamarblue、BrdU掺入免疫荧光双标法、流式细胞术检测了抑制性神经递质GABA（γ-aminobutyricacid）对成年小鼠脑室下区（sub ventricular zone,SVZ）来源的神经干细胞（neu—ral stem cell,NSC）增殖的影响。结果表明,成体NSCs被不同浓度的GABA和BICC干预后,GABA组增殖较空白对照组明显增强。BICC组的增殖则减弱;GABA组作用后增殖活跃期的NSCs比例明显高于空白对照组,BICC组增殖活跃期的NSCs比例明显降低沪〈O．05）;GABA作用组的处于s—G2期的细胞比例较对照组显著增加（P〈0．05）。该研究表明,GABA能促进成年小鼠SVZ区来源的NSCs进入增殖活跃期从而促进其增殖。     

神经干细胞移植对脑损伤大鼠整合素表达的影响

目的探讨神经干细胞（NSCs）移植对大鼠创伤性脑损伤（TBI）整合素（integrin）表达的影响。方法从E14大鼠胚胎分离NSCs,进行原代培养及传代培养;对NSCs进行诱导分化;采用免疫细胞化学技术对NSCs和其分化为神经元的表型进行鉴定。采用改良的Feeney法制备创伤性脑损伤模型。利用脑立体定位仪和微量注射泵进行NSCs脑内移植。采用免疫组织化学技术、免疫印迹技术和RT—PCR技术检测在移植后不同时间脑组织损伤区整合素的表达。结果在培养基中,NSCs呈球团状悬浮生长,Nestin表达阳性。用含10％胎牛血清的培养基对NSCs进行体外诱导分化后第2d,多数细胞伸出突起,以后突起逐渐延长,分支增加。分化后第5d,部分细胞呈βⅢ-微管蛋白阳性。整合素阳性产物主要表达于细胞膜,呈棕黄色。在对照组及移植组均可见阳性细胞表达。在不同时间点,NSCs移植组移植点及其周围脑组织中整合素的mRNA表达均显著高于对照组（P〈O．01）。整合素的蛋白表达结果和tuRNA表达结果相一致。结论移植NSCs至TBI大鼠损伤脑组织,在移植点周围脑组织中整合素的表达显著增加。     

2型糖尿病大鼠心肌IR、IRS-1的表达与罗格列酮及APP5肽类似物P165的干预效应

目的研究2型糖尿病大鼠心肌胰岛素信号转导通路蛋白胰岛素受体（IR）、胰岛素受体底物-1（IRS-1）的表达与正常SD大鼠的区别,并探讨进行罗格列酮及APP5肽类似物P165干预后对上述蛋白表达的影响。方法60只SD大鼠随机分为正常对照组（C组）、正常对照＋罗格列酮组（C＋RSG组）、2型糖尿病组（T2DM组）、2型糖尿病＋罗格列酮组（T2DM＋RSG组）、糖尿病给予P165小剂量组（T2DM＋P165小剂量组）、糖尿病给予P165大剂量组（T2DM＋P165大剂量组）,其中糖尿病动物采用高脂饮食后给予小剂量STZ腹腔注射的方法造模。后将各组SD大鼠处死,采用免疫组织化学染色和Western blot的方法检测心肌组织IR、IRS-1的表达。结果（1）2型糖尿病组（T2DM组）心肌组织IR、IRS-1的表达水平显著低于对照组（C组）;（2）2型糖尿病＋罗格列酮组（T2DM＋RSG组）心肌组织IR、IRS-1的表达水平显著高于T2DM组;（3）免疫组化染色发现2型糖尿病＋P165小/大剂量组（T2DM＋P165小/大剂量组）心肌组织IR、IRS-1免疫反应阳性颗粒沉着的累积光密度值显著高于T2DM组;Western blot结果显示T2DM＋P165小/大剂量组心肌组织IRS-1的表达水平显著高于T2DM组;而IR的表达水平与T2DM组相比无差别。结论（1）2型糖尿病大鼠心肌存在胰岛素抵抗或信号转导障碍;（2）罗格列酮干预后可以改善2型糖尿病心肌的胰岛素信号转导异常;（3）P165对2型糖尿病大鼠心肌胰岛素信号转导具有调节作用,其作用靶点可能为胰岛素受体底物。     

MiR-615在平行培养的神经干细胞与运动神经元的表达比较

目的探讨MiR-615在脊髓源性神经干细胞与运动神经元间的表达特征。方法通过免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓运动神经元;通过神经克隆球形成技术分离纯化胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞。采用TaqMan miR-615Assay定量检测培养的脊髓源性神经干细胞与运动神经元中miR-615的表达差异。结果通过平行培养技术分别获得了纯化的脊髓源性神经干细胞与运动神经元。定量检测结果显示,miR-615在分离的运动神经元中较在脊髓源性神经干细胞中显著高表达。结论本文提示miR-615可能在神经干细胞定向分化为运动神经元过程中发挥重要的调节作用。     

Effects of Homocysteine on ERK Signaling and Cell Proliferation in Fetal Neural Stem Cells In Vitro

The aim of the present study was to determine if the excitatory amino acid homocysteine (Hcy) alters ERK signaling and cell proliferation in fetal neural stem cells (NSCs) in vitro. NSCs were isolated from fetal rats and grown in serum-free suspension medium. The cells were identified as NSCs by their expression of immunoreactive Sox2. NSCs were assigned to one of four treatment groups: vehicle control, low-dose Hcy group (Hcy-L, medium contained 30 μmol/L Hcy), middle-dose Hcy group (Hcy-M, 100 μmol/L Hcy) and high-dose Hcy group (Hcy-H, 300 μmol/L Hcy). Cell proliferation was evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. Protein expression levels of ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2 were detected by Western blot. The effects of Hcy on NSC death, including apoptosis, were assessed by using flow cytometry and trypan blue exclusion. The results showed that NSCs grew as neurospheres in the serum-free medium. Hcy decreased ERK1/2 protein phosphorylation and NSC proliferation, but it did not induce cell death or apoptosis within the concentration from 30 to 300 μmol/L. The above results are consistent with the hypothesis that Hcy decreases fetal NSC proliferation by inhibiting ERK signaling.