胆甾醇基γ-聚谷氨酸负载阿霉素纳米胶束的制备与体内外释药性能评价

笔者制备了胆甾醇基γ-聚谷氨酸负载阿霉素纳米胶束(DOX/NPs),并考察了该载药纳米胶束体系的形态与粒径、载药量、包封率以及体内外释药的特性。结果表明:DOX/NPs的最佳载药量为22.4%,包封率为90.2%,平均粒径为(312.3±7.2)nm,电镜下观察呈现明显的核壳结构。体外释药结果显示,DOX/NPs能延缓阿霉素的释放,并具有p H敏感的释药特性。小鼠体内释药结果表明:阿霉素经包埋后其消除半衰期(t1/2)、药时曲线下面积(AUC)、平均滞留时间(MRT)均明显大于游离阿霉素,达到了药物缓释的目的。     

嵌段共聚物聚乙二醇-聚苹果酸苄基酯载药胶束的制备及性质研究

目的：为构建聚合物胶束药物运载体系,制备嵌段共聚物聚乙二醇-聚苹果酸苄基酯载药胶束并测定其性质。方法：以L-天冬氨酸为原料,重氮化、环化后经开环聚合得到聚苹果酸苄基酯。氨基聚乙二醇通过酰胺键连接到β-聚苹果酸苄基酯上形成两亲性嵌段共聚物,喜树碱做药物模型制备载药胶束。动态光散射法测定胶束粒径、评价胶束稳定性,高效液相法测定喜树碱载药率和包封率,芘荧光法与动态光散射法测定临界胶束浓度。结果：喜树碱包封率72%,载药率6%,临界胶束浓度为40μg.mL-1。随着聚苹果酸苄基酯分子量减小,胶束稳定性增强。结论：聚乙二醇-聚苹果酸苄基酯在疏水链/亲水链分子量比值为2-4时在水中可自组装形成纳米胶束,可作为性能优良的聚合物药物载体。     

聚苹果酸合成新方法及其聚苹果酸苄基酯用作药物载体的研究

目的:优化β-聚苹果酸(PMLA)的合成路线,制备部分氢化的聚苹果酸苄基酯(PMLABz),为构建载药纳米胶束提供两亲性聚合物载体。方法:分别以L-天冬氨酸和L-苹果酸为原料,合成单体β-苄氧羰基-β-丙内酯,再通过阴离子开环聚合制备PMLABz,最终氢化制备PMLA。X射线衍射仪、差示扫描量热仪等对材料的性质进行表征,L929成纤维细胞测定聚合物的细胞毒性,透析法制备部分氢化的聚苹果酸苄基酯空白胶束。结果:通过优化反应条件,以L-苹果酸为原料合成关键中间体β-苄氧羰基-β-丙内酯的终产率为31.5%,对比文献报道的L-天冬氨酸合成路线,产率提高近7倍。X-RD结果表明以L-苹果酸为原料制备的PMLABz有明显的衍射峰,结晶度高,熔点随之升高,MTT实验证实PMLABz无毒性。部分氢化的PMLABz可在水中自组装成一定粒径的胶束,氢化77%的PMLABz可得到粒径均匀、形态良好的纳米胶束。结论:分别以L-天冬氨酸和L-苹果酸为原料合成聚苹果酸,优化合成路线,提高终产率,得到了新晶型PMLABz,并通过部分氢化PMLABz制备两亲性聚合物进而得到纳米胶束,为后期纳米释药体系研究提供优良载体。     

不同D/L单体比γ-聚谷氨酸的合成与调控

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由L-谷氨酸和/或D-谷氨酸聚合而成的一种聚氨基酸,广泛应用于化妆品、医药等领域。高聚物单体的立体构型会影响产品性质和应用,因此调控γ-PGA中D-谷氨酸/L-谷氨酸单体比(D/L单体比)具有重要意义。前期以谷氨酸棒杆菌为底盘,表达来自于地衣芽孢杆菌的γ-PGA合成酶,合成以L-Glu(97.10%)为主的γ-PGA。通过外源添加不同浓度D-谷氨酸,合成了D-谷氨酸占比为15.71%~33.52%的γ-PGA。然后,在重组菌中表达来自于枯草芽孢杆菌的谷氨酸消旋酶,并使用三个不同强度RBS调控其表达水平,合成D-谷氨酸占比30.82%~34.59%的γ-PGA,但调控范围较窄。利用四个不同强度启动子调控谷氨酸消旋酶表达水平,扩大D/L单体比可调范围,合成D-Glu占比32.71%~52.53%的γ-PGA。提供一种理性调控γ-PGA的D/L单体比策略,实现了D-谷氨酸占比为2.90%~52.53%的γ-PGA的合成,为高效合成不同D/L单体比γ-PGA提供了基础。     

高分子聚合物的微生物合成与废弃物资源化

γ- 聚谷氨酸(γ-PGA)、γ- 聚苹果酸(γ-PMA)、细菌纤维素(BC)和聚羟基脂肪酸酯(PHA)等都是微生物合成的重要生物高分子聚合物.     

溶解氧对γ-聚谷氨酸合成的影响

在5L发酵罐上研究了溶解氧(DO)对地衣芽孢杆菌分批发酵生产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的影响并考察在8h、32h、56h时,葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的活性及对应时间点上γ-PGA的生产速率。通过溶解氧电极和搅拌转速的串联控制发酵过程中溶解氧水平,发现高溶解氧(60%)水平和低溶解氧(10%)水平均不能高效积累γ-PGA。6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的提高对产物的积累有抑制作用,葡萄糖激酶和谷氨酸脱氢酶的酶活提高对产物积累有促进作用,过高的丙酮酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的活性在一定程度上可以促进菌体生长但不利于产物的积累。此外,通过对三种不同DO水平下γ-PGA生物合成途径中相关代谢流量的计算表明,在p H 6.5的条件下,对于谷氨酸依赖型生产菌株,提高外源谷氨酸利用率可以促进γ-PGA的生物合成。     

γ-聚谷氨酸基因工程研究进展与展望

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种天然高分子可降解、环境友好型的新型阴离子聚合物。目前发现多种芽孢杆菌、古细菌和一种真核生物均可合成γ-PGA。根据其合成是否需要外加谷氨酸分为谷氨酸依赖性和谷氨酸非依赖型。γ-PGA的合成基因分为结合型的cap系和游离型的pgs系,其表达产物组成的γ-PGA合成酶复合体调节着γ-PGA的合成和转运。由于γ-PGA具有水溶性好、保湿性好、吸水性好、良好的生物兼容性和生物可降解性、可食用、对环境无污染等优点,在医药、农业、食品、环境、化妆品等领域具有广泛的应用前景。主要对γ-PGA的结构特点、微生物合成、相关基因、合成机理、应用、诱变处理进行综述。以期通过物理和化学等技术的诱变,获得γ-PGA的高产菌株,为提高γ-PGA产量提供依据。     

γ-聚谷氨酸的抗氧化及对UV辐射致皮肤细胞光老化的修复作用

寻找天然抗氧化物用于修复皮肤光老化问题是目前的研究热点之一。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物发酵制备的一种天然高分子聚合物材料,具有清除自由基的能力,但其抗氧化、抗皮肤光老化效果及与γ-PGA分子量的关系尚未明确。本文中,笔者考察不同分子量的γ-PGA对超氧阴离子自由基(·O~-_2)、羟基自由基(·OH)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(·DPPH)的清除能力。结果显示:不同分子量的γ-PGA对以上3种自由基均表现出一定程度的自由基清除活性,清除率可分别达31.36%、97.55%和74.64%。通过构建紫外线诱导小鼠皮肤成纤维细胞(L929)氧化损伤光老化模型,确定不同分子量的γ-PGA都能一定程度修复光老化细胞损伤并能减少光老化细胞中氧自由基(ROS)、氮自由基(NO)的增加,其中分子量3.0×10~5的γ-PGA修复光老化细胞损伤的效果最佳。     

透明颤菌血红蛋白在产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌WX-02中的表达

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.通过构建含有α-淀粉酶(amyE)基因两端交换臂的整合载体pDG1730-vgb,将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到聚γ-谷氨酸生产菌株地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02染色体中,获得重组子M2.一氧化碳差光光谱结果验证M2中表达了有活性的血红蛋白,3 L发酵罐分批发酵结果显示M2的生物量比出发菌株WX-02提高了25.5%,γ-PGA产量提高了20%.     

超声和pH响应的药物共转运纳米胶束的制备及其生物学性能初探

目的:制备一种超声和p H双重响应的同时载有阿霉素(DOX)与石胆酸(LA)的纳米胶束,实现两种药物的共转运。方法:将叠氮化的石胆酸(LA-(N3)_2)与两个丙炔胺化β-环糊精(β-CD-C≡CH)通过点击反应结合,得到一种两亲性β-环糊精二聚体(LA-(CD)_2)。该环糊精二聚体在水溶液中发生自组装,同时包裹疏水性药物阿霉素,最终得到阿霉素与石胆酸共转运的纳米胶束(LA-CD2/DOX)。通过核磁共振光谱和飞行时间质谱表征LA-(CD)2的结构,透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)表征共转运纳米粒的形貌和大小,动态透析法模拟体外释药,监测在不同p H值和超声作用下纳米胶束的释药特性,同时采用人口腔表皮样癌细胞(KB细胞)测定LA-(CD)2/DOX的细胞毒性。结果:1经核磁共振和飞行时间质谱表征LA-(CD)2成功合成。2透射电镜和动态光散射证实LA-(CD)2自组装成形态规整的纳米胶束,Dz=128 nm,PDI=0.21。3体外释药实验结果表明DOX的释药具有p H和超声双重响应性,而LA的释药只具有p H响应性。4细胞实验证实LA-CD2/DOX的细胞毒性高于DOX和LA。结论:LA-(CD)2/DOX可有望成为一种p H和超声双重响应的抗肿瘤药物共转运纳米载体。     

生物絮凝剂γ-聚谷氨酸絮凝性能研究

研究了枯草芽孢杆菌NX-2制备的生物絮凝剂γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的絮凝活性。γ-PGA对高岭土、活性炭等悬浮液具有较高的絮凝活性,絮凝活性稳定,热稳定性好,用量高于10mg／L时适用pH范围宽,最适投加浓度为20mg/L,加入Ca^2 、Mg^2 、Fe^3 、Al^3 、Fe^2 、Na^ 等金属离子能不同程度增强γ-PGA的絮凝活性,其中Ca^2 助凝效果最高。使用Ca^2 作助凝离子可降低γ-PGA用量,但Ca^2 浓度过高会明显降低γ-PGA的絮凝活性。还研究了γ-PGA对电镀废水的处理效果,实验证明γ-PGA能有效降低电镀废水中Cr^ 3、Ni^ 2等离子的浓度。     

共载依克立达和阿霉素的PBM-Hz-PEG纳米粒制备与性能研究

摘要 目的：研究不同比例依克立达（ELC）和阿霉素（DOX）的联合抗肿瘤效果,确定最佳联用比例。以生物可降解材料聚苹果酸苄基酯（PBM）为载体包封两种药物,得到一种酸敏感纳米胶束。方法：以L-天冬氨酸为原料通过内酯开环法制备PBM,并以酸敏感的腙键（Hz）连接PEG,得到嵌段聚合物PBM-Hz-PEG,红外光谱和核磁氢谱对其结构进行表征。动态透析法制备纳米胶束,测定纳米胶束的粒度、分散系数（PDI）、临界胶束浓度（CMC）及其载药量（DL）、包封率（EE）。动态透析法模拟胶束的体外释药性能,采用三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系考察载药纳米胶束的体外细胞毒性。结果：①ELC能够增敏DOX,二者摩尔比为1:3时有最强肿瘤抑制作用。②经红外光谱和核磁共振氢谱表征,嵌段共聚物PBM-Hz-PEG成功合成。③空白纳米胶束的粒径为69.67±11.55 nm,PDI为0.245 ± 0.026,CMC值为3.9 μg?mL^-1;载药纳米胶束粒径略大,粒径在96.92 ~ 113.47 nm之间,ELC和DOX的载药量与投料比一致。④载药纳米胶束在pH 7.4和pH 6.0时的药物释放率曲线和体外细胞毒性试验证实载药胶束具有良好的酸敏特性。结论：ELC和DOX联用有较强的肿瘤抑制作用,PBM是二者的优良载体。该PBM-Hz-PEG纳米胶束载药率高,其特有的酸敏性能够有效降低药物对正常组织的毒副作用,具有肿瘤组织富集释放特性,有望成为一种新型智能释药平台。     

枯草芽孢杆菌B53产聚γ-谷氨酸的絮凝特性

枯草芽孢杆菌B53产聚γ-谷氨酸(γ-PGA)对高岭土、Ca(OH)2、Mg(OH)2表现出较强的絮凝活性,采用0.6 g/L的γ-PGA溶液对高岭土的絮凝活性可达到90%以上。K 、Fe2 、Mg2 及Ca2 具有明显的促絮凝作用,而Al3 、Fe3 则起削弱作用。CaCl2浓度超过2 g/L及介质溶液维持pH值中性都有利于γ-PGA提高絮凝活性。     

地衣芽胞杆菌ATCC9945A中γ-聚谷氨酸降解酶基因的克隆、表达及降解性能鉴定

目的:验证在地衣芽胞杆菌ATCC9945A中存在着γ-聚谷氨酸降解酶基因(ywtD),为下一步解决在γ-聚谷氨酸微生物发酵合成过程中产物γ-PGA降解的技术性难题提供依据。方法:通过在pET-28b(+)大肠杆菌表达系统克隆表达地衣芽孢杆菌ATCC9945A中的ywtD基因,对诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE和Western Blot方法检测目的蛋白的表达,并体外酶解实验验证其活性。结果:PCR扩增得到了一个1 245bp的基因片段,预期编码414个氨基酸,诱导表达后得到一个分子量大小约为45.6 kDa的表达产物。Western Blot分析结果表明ywtD基因得到了有效表达。体外酶解实验表明该表达产物具有降解γ-PGA的活性。结论:证明在地衣芽胞杆菌ATCC9945A中存在着γ-聚谷氨酸降解酶基因。     

γ-聚谷氨酸与D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物的制备及其生物活性

介绍了制备一种γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物［poly (γ-glutamic acid)-D-galactose esterifiable derivative-cisplatin complex compound,γ-D+-DDP］,并考察其抗肿瘤活性。主要通过生物发酵获得大分子γ-聚谷氨酸［poly (γ-glutamic acid) ,γ-PGA］,利用酸降解得到可以作为药物载体的小分子γ-聚谷氨酸;利用凝胶色谱柱检验小分子γ-聚谷氨酸的分子量;利用MTT法检测该复合物的体外抗肿瘤作用。结果表明：成功获得γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物,该复合物载药率达9.4% ~10.2%;该复合物对人肝癌细胞BEL-7402具有显著的杀伤作用,能引起细胞凋亡(HE染色观察得到)。因此,γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物是一种有效的抗肿瘤药物,具有潜在的临床应用价值;生物发酵的γ-聚谷氨酸可用于药物载体,赋予药物新的特点。     

微生物合成γ-聚谷氨酸的相关基因、合成机理及发酵的研究进展

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种天然的氨基酸聚合物,由于其水溶性好、可生物降解、食用,以及对人类、动物和环境无毒等特点,因此,在环境、医药、食品和化妆品、饲料添加剂等领域有广泛的应用前景。主要是对微生物合成γ-PGA所采用的菌株、相关基因、合成机理及发酵方面进行综述。     

新型人工红细胞的制备

目的:接枝淀粉包裹血红蛋白制备新型人造红细胞的代替品。方法:利用油酸接枝淀粉,在超声条件下下自组装,包裹天然牛血红蛋白,并鉴定其物理化学及生物学性能。测定包封率、红外光谱分析(FTIR)、电镜观察形态学及粒径,测定P50和Hill系数。结果:人工红细胞呈圆球形,平均粒径250nm,包封率高,具有良好的携氧、释氧能力。结论:成功制备了人工纳米红细胞,为进一步临床应用提供了基础。     

巯基化γ-聚谷氨酸微纳米纤维及其抗氧化性能

以L-半胱氨酸(L-Cys)巯基化的γ-聚谷氨酸(γ-PGA-SH)为原料,利用静电纺丝法制备γ-PGA-SH微纳米纤维,经过二硫键(S—S)键交联γ-PGA-SS纤维,并研究交联后γ-PGA-SS纤维抗氧化性能。结果表明:通过核磁共振氢谱、红外光谱分析,发现巯基化聚谷氨酸制备成功,且接枝率为55.6%;扫描电子显微镜(SEM)分析发现,交联后γ-PGA-SS纤维直径由交联前γ-PGA-SH纤维直径的800 nm增加到1 100 nm;热重分析结果显示,交联后的γ-PGA-SS纤维热稳定性有所提高;通过γ-PGA-SS的抗氧化性能研究发现,2 mg的γ-PGA-SS纤维还原能力为0.81(吸光度值),·OH清除率为62.19%,DPPH·清除率为85.84%。综上所述,γ-PGA-SH原料制备成功,并且交联后γ-PGA-SS微纳米纤维有很好的抗氧化性能。     

肥料增效剂γ-聚谷氨酸对小青菜产量和品质的影响

研究了γ-聚谷氨酸(γ-PGA)肥料增效剂对盆栽小青菜产量和品质的影响.结果表明:正常施肥条件下,施用50 mg/kg的γ-PGA可以显著提高小青菜叶绿素、地下部鲜质量,使小青菜地上部鲜质量最大增产幅度达8.8％,与对照相比差异显著;同时还可以明显提高土壤铵态氮的含量,氮肥利用率增加10.6％.施用100 mg/kg的γ-PGA与对照相比,可降低小青菜中的硝酸盐含量44.8％,维生素C(Vc)含量提高18.1％,小青菜品质达到最好;当减施15％质量的氮肥时,20 mg/kg的γ-PGA可提高氮肥利用率10.2％～11.6％,说明在肥料缺乏时γ-PGA对小青菜产量、品质的改善效果显著.     

通过透明颤菌血红蛋白基因表达提高γ-聚谷氨酸的生物合成

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的微生物合成是高消耗氧的生物过程,采取基因工程手段改造γ-PGA生产菌株Bacillus subtilis NX-2,以提高细胞利用氧的能力。利用重叠PCR方法将P43强启动子与透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb拼接,插入大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒p MA5上,得到重组质粒p MA5-P43-vgb,并将其转化至B.subtilis NX-2中,从而获得重组菌B.subtilis NX-2(vgb+)。经SDS-PAGE分析和CO差光谱法证明VHb能在γ-PGA生产菌株中成功表达,且具有生理活性,大小约为1.6×104。在7.5 L发酵罐上对重组菌B.subtilis NX-2(vgb+)进行发酵性能考察,结果显示:重组菌比出发菌的生物量提高了41.2%,γ-PGA的产量提高了7.5%,传代多次表明重组菌具有良好的发酵稳定性。该研究为γ-PGA的进一步工业化生产奠定了基础。