粪肠球菌(Enterococcus faecalis)β酮脂酰ACP合成酶Ⅱ同源蛋白功能分析

FabB 和FabF是大肠杆菌(Escherichia. coli)脂肪酸合成的关键酶. 生物信息学分析显示，粪肠球菌基因组中有2个与大肠杆菌fabF同源的基因：fabF1和fabF2，缺少与fabB同源的基因. 用粪肠球菌(Enterococcus faecalis)V583总DNA为模板，PCR扩增 fabF1和 fabF2基因， 以pBAD24为载体，构建了重组质粒pHW13(fabF1)和pHW14(fabF2). 体内体外研究显示： fabF1基因能互补大肠杆菌fabB突变， FabF1具有β酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB)活性；fabF2能互补大肠杆菌fabF突变，FabF2 具有β酮脂酰ACP合成酶Ⅱ(FabF)活性. 同时发现粪肠球菌FabF2不同于大肠杆菌FabF，它还拥有微弱β酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB)活性，可使大肠杆菌fabB突变株产生少量的不饱和脂肪酸. 上述结果表明，FabF类酶 (FabF like enzyme) 同样可以具有β酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB) 活性.     

五个3-酮脂酰ACP合成酶同源蛋白的功能鉴定

大肠杆菌的FabB和FabF均具有长链3-酮基脂酰ACP合成酶活性.除参与长链饱和脂酰链的延伸外,FabB还是合成不饱和脂肪酸的关键酶之一,参与不饱和脂酰ACP的从头合成,最终生成顺-9-十六烯脂酰ACP.而FabF只能将顺-9-十六烯脂酰ACP延伸为顺-11-十八烯脂酰ACP,不参与不饱和脂酰ACP的从头合成.有研究表明,粪肠球菌、乳酸乳球菌、丙酮丁醇梭菌和茄科雷尔氏菌等细菌的FabF同源蛋白,具有类似大肠杆菌FabB和FabF的双功能.为证实该现象是否普遍存在,本研究选取了枯草芽孢杆菌BsfabF、中华苜蓿根瘤菌SmfabF、霍乱弧菌VcfabF、铜绿假单胞菌PafabF1和PafabF2 5个同源基因进行功能鉴定,体外酶学分析表明,5个FabF同源蛋白均具有长链3-酮基脂酰ACP合成酶活性,异体互补大肠杆菌CL28的脂肪酸组分分析显示,SmfabF、VcfabF、PafabF1和PafabF2具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ(FabF)活性,遗传互补大肠杆菌温度敏感突变株CY242和CY244的研究显示,仅有PafabF2编码的蛋白拥有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB)活性,能互补大肠杆菌fabB的突变.这表明不是所有的FabF同源蛋白均具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ和Ⅱ的双重活性.     

天蓝色链霉菌中长链3-酮脂酰ACP合成酶的功能

【背景】链霉菌属于放线菌科,在土壤环境中广泛分布。链霉菌具有复杂的形态分化和多样性的次生代谢网络,能产生大量具有生物活性的次级代谢产物,被广泛深入研究。【目的】天蓝色链霉菌是链霉菌的模式菌株,其脂肪酸合成代谢与次级代谢联系紧密,但目前脂肪酸合成代谢途径还不清楚,其长链3-酮脂酰ACP合成酶还未见报道。【方法】利用大肠杆菌FabF序列进行同源比对,发现天蓝色链霉菌A3(2)的基因组中,SCO2390(ScoFabF1)、SCO1266(ScoFabF2)、SCO0548(ScoFabF3)和SCO5886 (ScoRedR)具有较高的相似性,并具有保守的Cys-His-His催化活性中心,可能具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性。采用PCR扩增方法分别获得以上基因,连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌fabB(ts)突变株和fabB(ts)fabF双突变株,并检测转化子的生长情况。以上基因与pET-28b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并利用Ni-NTA纯化获得蛋白,体外测定其催化活性。将以上基因分别互补大肠杆菌fabF突变株后,GC-MS测定互补株的脂肪酸组成。【结果】4个同源基因中,只有ScofabF1能恢复fabB(ts)fabF双突变株42°C时在添加油酸条件下的生长,其他3个基因均不能恢复生长。而这4个基因都不能恢复fabB(ts)突变株42°C时生长。体外活性测定ScoFabF1具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性,其他3个蛋白都不具有该活性。仅ScofabF1能显著提高大肠杆菌fabF突变株的顺-11-十八碳烯酸(C18:1)比例,其他3个基因都不具有该功能。【结论】天蓝色链霉菌中ScofabF1编码长链3-酮脂酰ACP合成酶II,在脂肪酸利用过程中发挥重要作用。天蓝色链霉菌中没有发现编码长链3-酮脂酰ACP合成酶I的基因,其可能通过其他途径合成少量的不饱和脂肪酸。以上研究结果为进一步研究天蓝色链霉菌中脂肪酸合成机制奠定了基础。     

乳酸乳球菌fabZ1和fabZ2基因功能的鉴定

大肠杆菌(Escherichia coli)是Ⅱ型脂肪酸合成系统的模式生物,3-羟基脂酰ACP脱水异构酶(FabA)是不饱和脂肪酸合成中的关键酶.生物信息学分析表明,乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的基因组中没有标注为3-羟基脂酰ACP脱水异构酶的基因,但有两个标注为3-羟基脂酰ACP脱水酶基因LlfabZ1和LlfabZ2,其编码的蛋白质与EcFabZ的相似性分别为41%和45.1%,且都具有3-羟基脂酰ACP脱水酶两个保守的α螺旋结构.用携带LlfabZ1和LlfabZ2的质粒载体遗传互补大肠杆菌fabA温度敏感突变株CY57,在42℃下不能恢复生长,但无细胞抽提物的结果显示LlFabZ1能够使反-2-癸烯酰ACP异构成顺-3-癸烯酰ACP,而LlFabZ2则不能.互补大肠杆菌fabZ突变株HW7显示,在诱导的条件下,含有LlfabZ2的转化子能够恢复生长,而LlfabZ1则不能.体外重建脂肪酸合成反应及蛋白质活性测定表明,LlFabZ1具有3-羟基脂酰ACP脱水异构酶功能,而LlFabZ2只具有3-羟基脂酰ACP脱水酶功能.另外,未得到LlfabZ1和LlfabZ2的突变株,表明LlFabZ1和LlFabZ2可能是乳酸乳球菌脂肪酸合成酶系中的必不可少的关键蛋白.上述结果证实了乳酸乳球菌fabZ1和fabZ2两个基因在脂肪酸合成中的功能.     

不同细菌来源的3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ生物学特性分析

3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ(FabH)是催化细菌脂肪酸合成的起始反应.研究表明,革兰氏阳性细菌FabH对支链脂酰-CoA前体的选择性是其合成支链脂肪酸的关键.但部分革兰氏阴性细菌也产生一定量的支链脂肪酸,其合成机制还不清楚.为此,本研究选取了革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌BsfabH1和BsfabH2、金黄色葡萄球菌SafabH、天蓝色链霉菌ScofabH、革兰氏阴性细菌茄科雷尔氏菌RsfabH、大肠杆菌EcfabH,以及产支链脂肪酸的水稻黄单胞菌XoofabH,共7种fabH同源基因进行生物学特性分析.异体遗传互补茄科雷尔氏菌fabH突变株RsmH,表明这7个基因编码蛋白都具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ活性.脂肪酸组成分析显示,4个革兰氏阳性菌fabH和XoofabH互补株类似,均能产生支链脂肪酸,而EcfabH和RsfabH互补株不产生支链脂肪酸,说明XooFabH不同于EcFabH,参与支链脂肪酸合成.体外酶学分析表明,XooFabH与4种革兰氏阳性菌FabH类似,对支链脂酰-CoA有较高的选择,但EcFabH和RsFabH对支链前体活性低.与革兰氏阳性细菌FabH不同,XooFabH对中短链长(C4~C10)脂酰-CoA也具有较高的活性.综合以上结果,不同细菌来源FabH的生物学特性差异明显,FabH能利用支链前体是细菌合成支链脂肪酸的关键因素.     

大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶110位天冬酰胺突变后的结构与功能

3-酮基脂酰ACP还原酶催化3-酮基脂酰ACP还原为3-羟基脂酰ACP,是细菌脂肪酸合成反应的关键酶之一.为了明确该酶中110位的保守天冬酰胺残基在酶催化活性和酶结构中的作用,本研究采用基因定点突变和蛋白质表达纯化技术,获得了大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶FabG的两个突变蛋白：FabG N110Q和FabG N110L.圆二色谱结果显示,天冬酰胺残基的突变改变了FabG的空间结构,使突变蛋白的α螺旋结构明显增加.以3-酮脂酰ACP为底物的酶活性测定表明,突变蛋白的酶活性均有下降,但残存的酶活性达到了FabG的75%以上.突变蛋白FabG N110Q和FabG N110L具有3-酮基脂酰ACP还原酶的活性,能在体外重建细菌脂肪酸合成反应.对fabG温度敏感突变株的遗传互补分析表明,FabG蛋白110位天冬酰胺突变为谷氨酰胺或亮氨酸后,在一定的条件下仍能互补大肠杆菌的生长.本研究结果提示,FabG 110位的天冬酰胺残基不是参与3-酮基脂酰ACP还原酶催化反应的必需氨基酸,它只是作为结构氨基酸,在维持FabG的空间结构的稳定性方面起作用.     

野油菜黄单胞菌中3-羟基脂酰ACP脱水酶功能研究

细菌采用II型脂肪酸系统合成脂肪酸,其中3-羟脂酰ACP脱水酶催化唯一的脱水反应,是细菌生长的关键酶之一.野油菜黄单胞菌(Xcc)引起几乎所有十字花科植物的黑腐病,在全球范围内造成广泛的经济损失.为研究Xcc中3-羟脂酰ACP脱水酶,本研究利用大肠杆菌3-羟脂酰ACP脱水酶FabZ序列同源比对时,发现其与XC_2876 (XcfabZ)编码蛋白具有同源性,序列一致性达到46.1%,同时还具有保守的α螺旋结构和活性位点.将XcfabZ异体遗传互补大肠杆菌fabZ(EcfabZ)条件突变株HW7,结果显示添加IPTG能恢复突变株的生长,初步表明XcFabZ具有3-羟脂酰ACP脱水酶活性.而体外活性分析显示,XcFabZ能在脂肪酸合成的起始反应和延伸反应中发挥3-羟脂酰ACP脱水酶活性作用.本研究不能直接获得XcfabZ基因敲除突变株,但将携带EcfabZ或XcfabZ的表达质粒导入后,获得基因替换突变株,证明XcfabZ是必需基因. EcfabZ替换突变株的脂肪酸组成与野生菌有差异,对逆境条件(高盐、低pH、H_2O_2和SDS)的耐受性显著下降,运动性也显著降低,但XcfabZ替换突变株恢复到野生菌水平,表明XcFabZ与EcFabZ虽然都具有3-羟脂酰ACP脱水酶活性,但在细胞中生理功能可能有一些差别.     

苜蓿中华根瘤菌fabA和fabB基因功能的鉴定

在大肠杆菌(Escherichia coli)脂肪酸合成酶体系中,fabA基因编码有双功能的3-羟基脂酰ACP脱水异构酶,其异构产物能被fabB基因编码的3-酮基脂酰ACP合成酶Ⅰ延伸,合成不饱和脂肪酸,该FabA-FabB途径被认为是缺氧条件下不饱和脂肪酸合成的经典途径．生物信息学分析发现,苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的SmFabA与EcFabA相似性达到60.6%,具有相同的保守活性位点和两个保守的α螺旋结构;SmFabB与EcFabB相似性达到61.1%,具有相同的Cys-His-His活性中心．用携带SmfabA和SmfabB的质粒载体遗传互补大肠杆菌温度敏感突变株CY57和CY242,在添加三氯森(TCL)抑制烯脂酰ACP还原酶活性的条件下,转化子能在42℃恢复生长,且放射性薄层层析能检测到转化子中不饱和脂肪酸棕榈油酸(Δ9C16:1)和十八碳烯酸(Δ11C18:1)的合成．体外重建脂肪酸合成反应表明,SmFabA能催化羟脂酰ACP的脱水反应且能够使反-2-癸烯酰ACP异构化,SmFabB能催化不同链长的脂酰ACP和丙二酸单酰ACP的聚合反应．另外,未得到SmFabA和SmFabB的突变株,表明SmFabA和SmFabB可能是苜蓿中华根瘤菌脂肪酸合成酶系中必不可少的关键蛋白．上述结果证实了苜蓿中华根瘤菌fabA和fabB两个基因在不饱和脂肪酸合成中的功能．     

流产布氏杆菌烯脂酰ACP还原酶的鉴定

烯脂酰ACP还原酶是细菌脂肪酸合成的关键酶之一．流产布氏杆菌基因组有2个注释为烯脂酰ACP还原酶基因fabI的同源基因：fabI1和fabI2．由这2个fabI同源基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌FabI有50%和51%的同源性,且都拥有与大肠杆菌FabI一样的催化中心Tyr-(Xaa)₆-Lys序列．分别用携带这2个同源基因的质粒载体转化大肠杆菌fabI温度敏感突变菌株JP1111．转化子能在42℃生长,表明这2个基因均能遗传互补大肠杆菌fabI突变,并使此菌株恢复脂肪酸的合成．另外,体外酶学分析显示,由这2个同源基因编码的蛋白质都拥有烯脂酰ACP还原酶活性,均能参与细菌脂肪酸合成．上述结果证实,流产布氏杆菌同时拥有2个同种类型的烯脂酰ACP还原酶,是一种新的烯脂酰ACP多样性的表现．     

野油菜黄单胞菌中烯脂酰ACP还原酶的功能鉴定

烯脂酰ACP还原酶是细菌脂肪酸合成的关键酶之一.本研究通过生物信息学分析发现,野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris(Xcc)8004基因组中XC_0119(Xccfab V)注释为反-2-烯脂酰Co A还原酶基因.但其编码产物与铜绿假单胞菌的烯脂酰ACP还原酶Fab V具有较高的同源性,并含有相同的催化活性中心Tyr-(Xaa)8-Lys序列.用携带Xccfab V的质粒载体互补大肠杆菌fab I温度敏感突变株JP1111,转化子能在42℃生长,表明Xccfab V能遗传互补大肠杆菌fab I突变.体外重建脂肪酸合成反应表明,Xcc Fab V能催化不同链长的烯脂酰ACP还原为脂酰ACP,且催化活性不受三氯森抑制.遗传学研究表明,Xccfab V是必需基因,不能获得Xccfab V基因敲除突变株.将携带大肠杆菌fab I的外源质粒导入野生菌后,可敲除染色体上的fab V基因,获得的替换突变株生长特性和脂肪酸组成未发生显著变化,但替换突变株对三氯森敏感.上述结果证实,野油菜黄单胞菌fab V是必需基因,编码烯脂酰ACP还原酶,参与脂肪酸从头合成反应,且Fab V是Xcc对三氯森耐受的根本原因.     

茄科雷尔氏菌脂酰-CoA合成酶的功能鉴定

【目的】茄科雷尔氏菌是一种常见的农作物致病菌,引起植物青枯病。研究其脂肪酸代谢途径将有助于寻找新的抗菌药物靶点,为防治青枯病害提供新的思路。【方法】利用大肠杆菌FadD序列,进行同源比对发现茄科雷尔氏菌GMI1000中RSc2857(RsFadD)具有较高的相似性,推测其具有脂酰-CoA合成酶活性。采用PCR扩增方法获得RsfadD基因,连入表达载体pBAD24M后互补大肠杆菌fadD突变株,并检测转化子的生长情况。RsfadD与pET-28b连接后,在大肠杆菌BL(DE3)中表达,并利用Ni-NTA纯化获得带有组氨酸标签的RsFadD,体外测定RsFadD的活性。利用同源重组方法,获得RsfadD敲除突变株,分析突变株的生长性状。【结果】RsfadD异体互补大肠杆菌fadD突变株,恢复突变株在以脂肪酸为碳源的基础培养基上生长。体外活性测定RsFadD具有脂酰-CoA合成酶活性,对不同链长的脂肪酸都具有活性,但活性低于大肠杆菌FadD。RsfadD突变株在添加不同链长脂肪酸的基础培养上仅能微弱生长,而在丰富培养基上生长无差异。【结论】茄科雷尔氏菌中RsfadD编码脂酰-CoA合成酶,在脂肪酸利用过程中发挥重要作用。但RsfadD突变株在基础培养基上微弱生长,说明茄科雷尔氏菌基因组中还有其他的脂酰-CoA合成酶基因。以上研究结果为进一步研究茄科雷尔氏菌中脂酰-CoA合成酶以及脂肪酸利用机制奠定了基础。     

恶臭假单胞菌中3-酮脂酰ACP还原酶FabG5是脂肪酸合成关键酶

3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化脂肪酸合成中的第一步还原反应,是细菌生长的关键酶之一.恶臭假单胞菌在环境污染治理和工业聚羟基脂肪酸(PHA)的生产中,都具有重要的应用价值.生物信息学分析显示,恶臭假单胞菌基因组编码6个FabG同源蛋白质,与大肠杆菌FabG相比较,PpFabG5序列相似性最高(76.5%),其他几个PpFabG也都具有较高的序列相似性(约50%).除PpFabG4之外,其他的同源蛋白质都具有催化活性位点和N端辅因子结合位点.为研究恶臭假单胞菌中这6个FabG同源蛋白质的生物学功能,本文进行了异体遗传互补、体外酶学活性分析、体内基因敲除与突变株性状分析等研究.结果显示,只有PpfabG1、PpfabG3、PpfabG5能恢复大肠杆菌fabG温度敏感突变株CL104在42℃时生长,其中PpfabG1互补株生长较弱.而在体外活性检测中,PpFabG1、PpFabG3和PpFabG5在脂肪酸合成起始反应和延伸反应中都具有催化活性,但PpFabG1活性较弱,PpFabG6仅在起始反应中具有催化活性. PpfabG5是恶臭假单胞菌生长的必需基因,不能被敲除,而其他几个PpfabG基因敲除后不影响菌体的生长,突变株的脂肪酸组成与野生菌也无差异.但PpfabG1、PpfabG2敲除后菌体的运动性下降,PpfabG3、PpfabG6突变影响了生物被膜的合成量,而PpfabG4、PpfabG6敲除突变株对H2O2的耐受性增强,表明这些基因具有不同的生理功能,可能在菌体的不同逆境中发挥作用.     

应用基因敲除快速构建大肠杆菌突变体改造脂肪酸代谢途径

【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。     

北京棒杆菌DAHP合成酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及表达

[目的]从北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)中克隆DAHP合成酶(EC 2.5.1.54,3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase,DS)Ⅰ基因,对其进行功能验证;并将DAHP合成酶Ⅰ基因在C.pekinensePD-67进行同源表达,研究该酶的比活力与生长的相关性.[方法]分别以C.pekinense野生株ASl.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增了DAHP合成酶Ⅰ的全基因序列aro Ⅰ和前端控制序列;通过pAK6载体提高DAHP合成酶Ⅰ基因在C.pekinen-sePD-67中的拷贝数实现其同源表达.[结果]核苷酸序列分析结果表明,C. pekinense野生株AS1.299与突变株PD-67相比较,DAHP合成酶Ⅰ基因序列完全一样;通过PCR方法得到的DAHP合成酶Ⅰ基因结构功能完整,能与DAHP合成酶完全缺陷的E.coli 3257实现异源互补.突变株PD-67来源的DAHP合成酶Ⅰ基因在重组菌PD-67(pAD1)中进行了表达,在稳定期初期重组菌PD-67(pAD1)的DAHP合成酶Ⅰ的酶比活力比同期的对照菌株PD-67(pAK6)中的该酶酶比活力提高了约5倍.[结论]本工作首次证实了C. pekinense 1.299和PD-67中存在DAHP合成酶Ⅰ基因,异源互补试验证明扩增得到的DNA片段编码DAHP合成酶Ⅰ,酶学性质研究表明DAHP合成酶Ⅰ基因在C. pekinensePD-67中的同源表达将有助于提高该菌的色氨酸积累.     

北京棒杆菌DAHP合成酶Ⅰ基因的克隆﹑序列分析及表达

摘要：【目的】从北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)中克隆DAHP合成酶 (EC 2.5.1.54,3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase, DS)Ⅰ基因,对其进行功能验证;并将DAHP合成酶Ⅰ基因在C. pekinensePD-67进行同源表达,研究该酶的比活力与生长的相关性。【方法】分别以C. pekinense野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增了DAHP合成 酶Ⅰ的全基因序列aroⅠ和前端控制序列;通过pAK6载体提高DAHP合成酶Ⅰ基因在C. pekinen-sePD-67中的拷贝数实现其同源表达。【结果】核苷酸序列分析结果表明,C. pekinense 野生株AS1.299与突变株PD-67相比较,DAHP合成酶Ⅰ基因序列完全一样;通过PCR方法得到的DAHP合成酶Ⅰ基因结构功能完整,能与DAHP合成酶完全缺陷的E.coli 3257实现异源互补。突变株PD-67来源的DAHP合成酶Ⅰ基因在重组菌PD-67( pAD1)中进行了表达,在稳定期初期重组菌PD-67( pAD1)的DAHP合成酶Ⅰ的酶比活力比同期的对照菌株PD-67( pAK6)中的该酶酶比活力提高了约5倍。【结论】本工作首次证实了 C. pekinense 1.299和PD-67中存在DAHP合成酶Ⅰ基因,异源互补试验证明扩增得到的DNA片段编码DAHP合成酶Ⅰ,酶学性质研究表明DAHP合成酶Ⅰ基因在C. pekinensePD-67中的同源表达将有助于提高该菌的色氨酸积累。     

大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成

[目的]获得高纯度大肠杆菌holo-ACP和多种长链脂酰ACP,为研究细菌脂肪酸、类脂A和N-酯酰高丝氨酸内脂等物质的合成提供底物.[方法和结果]采用PCR方法扩增得到大肠杆菌酰基载体蛋白基因(acpP)和holo-ACP合成酶基因(acpS).使用载体pBAD24、pBAD34和pET28b分别克隆了acpP和acpS,得到pBAD-ACP、pET-ACP和pET-ACP-ACPS 3个ACP表达质粒和一个AcpS表达质粒pBAD-ACPS.分别用3个ACP表达质粒转化大肠杆菌DH5a和BL21(DE3),构建了DH5αpBAD-ACP、BL21(DE3)/pET-ACP和BL21(DE3)/pET-ACP-ACPS 3种ACP生产菌株.与holo-ACP纯化常用菌株DK574相比,虽然三菌株在诱导时均能过量表达ACP,但是holo-ACP所占比例偏低.为了提高ACP生产菌株holo-ACP的产量,用质粒pBAD-ACPS分别转化上述3种ACP生产菌株,获得了3种携带双质粒的ACP生产菌株.表达结果显示携带pBAD-ACP和pBAD-ACPS双质粒的DH5a菌株比DK574菌株能产生更多的holo-ACP,且纯度也得到提高(纯度达99%).同时使用UNOsphere Q阴离子交换层析从这一菌株培养物中分离纯化到了高纯度的holo-ACP,并以纯化到的holo-ACP和多种长链脂肪酸为底物在哈氏弧菌脂酰ACP合成酶的催化下,合成了多种长链脂酰ACP.[结论]通过研究获得一株holo-ACP高产菌株,并证明在大肠杆菌菌株中,同时表达acpP基因和acpS基因,有利于holo-ACP的产生.     

来源于大肠杆菌的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖异构酶的原核表达与活性测定

同源性搜索显示大肠杆菌中存在核酮糖单磷酸途径关键酶6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)基因的同源序列,但没有其相关活性和功能方面的报道.本研究利用PCR方法从大肠杆菌的基因组中扩增hps和phi的同源序列(分别简称为Ehps和Ephi),构建了大肠杆菌Ehps和Ephi基因的原核表达载体pDEST17-Ehps和pDEST17-Ephi,表达和纯化了重组蛋白EHPS和EPHI,酶活性检测结果表明EHPS和EPHI具有活性.     

禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2(血清型O2:K89)Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株A2△fimH::Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20(温度敏感性)以去除上述缺失突变株中抗性基因标志,结合PCR扩增和测序结果,证明fimH基因缺失株.A2△fimH的正确构建.通过fimH基因互补试验使A2△fimH缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性.红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,野生株呈现良好的凝集效果,并能被0.5%甘露糖完全抑制,而A2△fimH缺失突变株未呈现任何凝集现象.体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下,A2△fimH缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株.禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株成功构建,为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制,肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础.     

细菌3-酮脂酰ACP还原酶研究进展

3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)在细菌中广泛存在并且十分保守,已经发现的所有FabG及其同系物都具有类似的催化活性中心序列,隶属于短链醇脱氢酶/还原酶(SDRs)超家族成员。它是Ⅱ型脂肪酸合成反应中的关键酶,将3-酮脂酰ACP还原为3-羟脂酰ACP多以NADPH作为辅酶。从搜集的文献来看,国内外针对不同细菌中3-酮脂酰ACP还原酶同系物的研究报道体现了其多样性的特点。但是,近年来,该方面的专题综述十分少见。本文主要对3-酮脂酰ACP还原酶的结构特征、在脂肪酸合成和其他方面的生物学功能,以及以该酶为作用靶点的抑菌剂等方面进行概述,以期为将来3-酮脂酰ACP还原酶的深入研究提供理论参考。     

异油酸含量对铜绿假单胞菌群集运动能力的影响

摘要:【目的】研究铜绿假单胞菌的脂肪酸组成对群集运动(swarming)的影响及可能的原因。【方法】通过双交换原理敲除铜绿假单胞菌PAO1脂肪酸合成的一个重要基因fabF,构建fabF缺失突变体;构建pUCP18Gm-fabF质粒大量表达FabF,对缺失体进行回补。比较野生型、缺失体和回补后菌株的swarming能力。利用气相色谱分析野生型、缺失体和回补后菌株的脂肪酸组成变化,以揭示FabF表达影响swarming能力的可能原因。【结果】获得了假单胞菌的fabF缺失突变体YFF-1,证实了fabF敲除后假单胞菌的 swarming能力消失,fabF回补后细菌的swarming能力得以恢复。气相色谱结果显示,突变后脂肪酸组成发生明显变化,异油酸(C18:1 Δ11)含量由33.6%急剧下降至8.9%,不饱和脂肪酸:饱和脂肪酸(USA:SFA)也由0.96下降至0.74;fabF回补后,异油酸含量恢复至20.9%,USA:SFA也上升至1.09。【结论】铜绿假单胞菌fabF基因的表达水平对细菌的swarming能力具有重要影响,突变体中异油酸含量的下降及脂肪酸不饱和程度的降低(尤其是异油酸含量的急剧下降),可能是YFF-1 swarming能力消失的重要原因。