常规诱变结合高通量筛选选育可利霉素高产菌株

可利霉素是通过基因工程定向育种技术获得的新型大环内酯类抗生素,是国家一类新药.[目的]为满足工业化生产需要,其工程菌株的发酵水平有待提高.[方法]多种常规诱变技术交替处理和高通量筛选方法选育可利霉素高产菌株,处理方法包括原生质体紫外诱变、DES(硫酸二乙酯)诱变、紫外光复活诱变、缬氨酸抗性筛选和正突变菌株的富集.[结果]高产菌株WSJ-1-7-49-133-82-43的摇瓶生物效价比出发菌株WSJ-1-7-49提高56％,500L中试发酵罐突变菌株效价较出发株高61％.[结论]说明多轮常规诱变育种结合高通量的筛选方法可以用于工业生产菌株的高效筛选.     

采用复合诱变方法选育高产β-半乳糖苷酶菌株

目的:研究复合诱变方法选育高产β-半乳糖苷酶菌株.方法:以马克斯克鲁维酵母为出发菌株,经过紫外线诱变及硫酸二乙酯、亚硝基胍复合诱变,从大量突变株中进行筛选.结果:成功地选育出一株高产、稳定的菌株15D,其产酶活力由出发菌的124.5U/mg提高到172.4U/mg,酶活力提高了约1.4倍.结论:该方法选育β-半乳糖苷酶菌株是有效的.     

新一代糖化酶高产菌株的选育及其工业应用

【目的】建立对糖化酶生产菌种黑曲霉随机突变文库进行筛选的方法,以获得糖化酶酶活提高的突变菌株。【方法】以一株可产糖化酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger X1为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变获得突变文库,采用葡萄糖的结构类似物——2-脱氧葡萄糖进行筛选,并在筛选过程中逐渐提高2-脱氧葡萄糖浓度,定向选育具有2-脱氧葡萄糖抗性、高产糖化酶的突变株。【结果】获得的高产突变菌株DG36摇瓶发酵糖化酶产量比出发菌株A.niger X1提高22.2%–33.8%,经工业水平50 m~3罐发酵测试,突变株DG36发酵128 h糖化酶活可达49094 U/m L,在相同发酵时间内,其酶活较出发菌株A.niger X1提高32.8%,发酵时间缩短16.9%。【结论】本研究开发了一种以2-脱氧葡萄糖为抗性标记选育高产糖化酶突变株的方法,所得突变株DG36遗传性状稳定,与出发菌相比具有菌丝粗壮、产酶期提前、糖化酶活高、发酵时间短、有利于发酵后处理的优点。     

产紫杉醇菌株原生质体诱变育种的研究

对紫杉醇产生菌NCEU-1的原生质体进行了紫外线和氯化锂复合诱变,筛选制霉菌素抗性突变株,共筛选出了4株正突变株。经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产紫杉醇的原生质体诱变菌株——UL_04-5,其紫杉醇产量从出发菌株的314.07μg/L提高至418.24μg/L。     

UV与NTG复合诱变选育咪唑立宾高产菌

为选育咪唑立宾的高产菌株,对咪唑立宾产生菌Eupenicillum sp.E-0509-2的孢子分别进行了紫外线照射(UV)、亚硝基胍(NTG)和UV+NTG复合诱变处理筛选突变株。结果表明试验所确定的咪唑立宾产生菌的孢子诱变适宜条件为:将孢子悬液在电磁搅拌下,经紫外线照射处理60s后,以3.0g/L NTG处理20min。经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产咪唑立宾的诱变菌株Eupenicillum sp.E-UN41,其咪唑立宾产量较出发菌株提高13倍。     

微波诱变结合化学诱变选育纤维素酶高产菌的研究

以纤维素酶产生菌TP1202为出发菌株,通过微波诱变和硫酸二乙酯、氯化锂诱变剂进行诱变,选育到1株纤维素酶高产菌株AS5。在适宜条件下,其产生的羧甲基纤维素酶活力(CMC),滤纸酶活力(FPA)和棉花糖酶活力分别是出发菌株的107%、152.4%和140.5%。     

原生质体诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌株

以白色链霉菌UN2-71为出发菌株,对其原生质体进行硫酸二乙酯(DES)诱变,选育ε-聚赖氨酸高产菌株。经过试管初筛和摇瓶复筛,得到1株稳定性好的菌株D3-32,摇瓶产量达到1.56g/L,比出发菌株提高49.43%。采用2.3L发酵罐进行发酵试验,控制pH分两阶段培养后,ε-聚赖氨酸最高产量达到4.59g/L,比出发菌株提高了2.65倍。     

紫外线和硫酸二乙酯复合诱变选育PHB高产菌株

【目的】获得高产聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyricacid,PHB)菌株。【方法】以假单胞菌属Pseudomonas koreensis PK3菌株为出发菌株,采用硫酸二乙酯和紫外线相结合的诱变方法进行多轮诱变。【结果】经过初筛和复筛得到一株高产PHB突变菌株,命名为Pseudomonas koreensis UVCN-18。连续传代9次后,发酵28 h条件下,PHB产量达到15.94 g/L,占细胞干重69.54%,较原出发菌株Pseudomonas koreensis PK3(4.42 g/L)提高了2.61倍,并且该菌株具有良好的遗传稳定性。【结论】采用硫酸二乙酯和紫外线相结合的诱变方法,成功获得了一株高产PHB突变菌株。     

河内白曲霉酸性α-淀粉酶高产菌株的诱变选育

采用不同浓度的硫酸二乙酯(DES)诱变处理萌发的河内白曲霉孢子,后涂布于筛选培养基,根据透明圈大小初筛高产酸性α-淀粉酶的突变株,并进行摇瓶复筛。结果表明:将萌发的河内白曲霉孢子于1%DES处理20 min,致死率为84.3%,后涂布筛选获得一株高产酸性α-淀粉酶的突变株Hanoi white starter 4,发酵后酶活力达20.8 U/g,比野生菌株提高了61.2%,且遗传稳定性良好。     

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示:从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

一种用少量标本快速构建老年性白内障消减cDNA文库的方法

为从少量标本中获得含较多大片段的、高质量的老年性白内障消减cDNA文库,利用磁珠分离、生物素标记的改良消减杂交法获得差异cDNA,利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA,从而成功构建老年性白内障消减cDNA文库.在文库中随机挑取的22个克隆中,1 000 bp以上的片段有7个,占31.8%,750 bp以上有15个,占68.2%.所得cDNA片段较大,可以满足下一步研究需要.改良消减杂交法结合选择性PCR法可以从少量标本中快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库.     

Identification of calconectin, a calcium-binding protein specifically expressed by the mantle of Pinctada margaritifera

Nacre or mother-of-pearl in the shell of Pinctada margaritifera is composed of 95-99% calcium carbonate and 1-5% organic matrix. In this study, we developed an original technique to characterize the genes differentially expressed in nacre-forming cells (NFC) by combining suppression subtractive hybridization (SSH), to establish a cDNA subtractive library, with rapid amplification of cDNA ends (RACE)-PCR. Seventy-two specific cDNA sequences have been obtained so far. These include a protein containing two EF-hand Ca2+-binding domains which was completely sequenced after amplification by RACE-PCR. Its specific expression as well as the specificity of the SSH method was confirmed by semi-quantitative RT-PCR on NFC and mantle cells.     

应用抑制性消减杂交技术克隆大鼠肝再生过程中特异表达基因

应用抑制性消减杂交技术成功地构建了高消减效率的正向消减cDNA文库,从随机挑取的50个克隆中有31个均检出了60~400bp插入片段,对这些插入cDNA片段进行测序后经Genbank同源性检索,表明其中7个片段为未知新序列。大鼠肝切除后肝再生cDNA正向消减文库的建立为进一步大批量筛选、克隆肝再生特异性表达的未知新基因奠定了基础,初步筛选出的特异性表达的序列标记为进一步研究肝再生中基因的功能提供了依据。 Abstract:The cDNA from rat regenerating liver tissue was used as the tester and that from normal liver was used as the driver.A highly efficient subtractive cDNA library was constructed by suppression subtractive hybridization(SSH).After screening,31 clones from 50 clones which were derived from the cDNA library were inserted by 60~400bp cDNA fragments.24 cDNA fragments corresponded to known genes and 7 cDNA fragments were unknown sequences(GenBank accession number:BG447490~447496).     

A simple, effective method for the construction of subtracted cDNA libraries

A simple method is described for the construction of subtracted cDNA libraries. The technique was used to create a human pancreatic tumor cDNA library that was screened using either hybridization with cDNA probes or antibodies. cDNA from a well-differentiated tumor cell line (CD-11) was subtracted against RNA from an undifferentiated tumor cell line (Panc-1). The subtracted cDNA was purified from RNA-cDNA hybrids by oligo-dA cellulose affinity chromatography. Single-stranded subtracted cDNA was used as a template for random primed second-strand synthesis using the Klenow's fragment of DNA polymerase. After ligation with Eco R1 adapters, cDNA was inserted into lambda gt11. A library of 140,000 primary pfu was obtained that contained 92% recombinants. A small portion of this library (40,000 pfu) was subjected to probe screening with a mucin cDNA probe known to be differentially expressed by CD-11 cells. The ratio of mucin cDNA clones to actin cDNA clones was increased by greater than 300-fold in the subtracted cDNA library compared to a standard cDNA library from the same cell line. The absolute number of mucin cDNA clones per 40,000 pfu was also increased 32-fold in the subtracted library. Pancreatic tumor mucin cDNAs were also identified in the subtracted library by antibody screening. The subtraction procedure yielded a 50-fold enrichment in differentially expressed cDNA detected by antibodies, compared to a nonsubtracted library from the same cell line.     

红曲菌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建红曲菌产桔霉素和不产桔霉素差异表达的cDNA消减文库.分别从产桔霉素和不产桔霉素的红曲菌丝体中提取mRNA,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成大小为250～750bp的片断,将产桔霉素的cDNA分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与不产桔霉素的红曲菌的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,文库扩增后得到283个克隆,经PCR法快速测定,均得到250～750bp的插入片断.所构建的红曲菌cDNA消减文库为进一步筛选红曲菌中与产桔霉素性状相关的基因奠定了基础.     

东方山羊豆盐诱导抑制差减杂交文库构建及其表达序列标签分析

为筛选东方山羊豆盐诱导差异性基因,以250 mmol/L NaCl处理的东方山羊豆cDNA为实验组,未经诱导刺激的为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建消减文库并对其部分阳性克隆进行了ESTs序列分析。该消减文库克隆的重组率为92%,插入片段大部分集中在0.2～1kb之间。随机挑取500个克隆进行测序及同源性分析,获得258个cleanESTs,经聚类、拼接,去除冗余序列,共获得132个Unigene,其中含有32个contigs和100个singlets,该文库的冗余度为24%。对其进行功能预测及分类,得到大量参与信号转导、转录调控、渗透和代谢调节、机体防御以及光作用等过程的相关基因。随机选择非重复的4个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率,结果显示,诱导组的表达量显著高于非诱导组,表明该文库有较高质量,且所采用的技术手段有助于快速发现东方山羊豆新功能基因。     

甜菜M14品系花期cDNA文库的构建及特异表达基因的筛选

构建了甜菜M14品系在花期的ZAP表达载体的cDNA文库,利用抑制消减杂交方法所获得的M14品系特异表达的2个EST片段为探针筛选cDNA文库,获得了M14品系特异表达cDNA片段Me-86和Me-84;进一步利用RACE技术获得了基因M14-86 cDNA片段的全长序列。生物信息学分析表明M14品系特异表达基因M14-86的cDNA片段与cDNA片段Me-84分别与大花马齿苋(Portulaca grandiflora)及瓶子草(Sarracenia purpurea)的26S核糖体RNA具有很高的同源性。