猴B病毒抗体ELISA检测方法的建立和应用研究

目的　建立猴B病毒抗体ELISA检测方法。方法　采用方阵滴定法 ,比较不同血清稀释度、3种酶结合物、2种抗原对检测结果的影响 ,与国外同类参比实验室进行检测结果的比较 ,确定ELISA法的最佳实验条件。结果　HSV抗原包被浓度 10 μg ml,抗人IgG HRP为 1∶2 0 0 0时 ;或B病毒抗原包被浓度 10 μg ml,抗人IgG HRP为1∶4 0 0 0时 ,阴性血清和阳性血清的A值差距最大。与国外B病毒检测专业实验室的检测结果符合率分别为98 0 2 %和 97 5 2 %。结论　建立了猴B病毒抗体的ELISA检测方法 ,提高了检测方法的准确性。     

乙型脑炎病毒（JEV）ELISA检测方法的建立

目的建立猪乙型脑炎病毒（JEV）抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2μg/mL、10μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%,批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。     

犬瘟热病毒（CDV）ELISA检测方法的建立与应用

目的建立犬CDV抗体ELISA检测方法。方法培养vero细胞,接种CDV病毒,制备vero正常抗原和CDV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为1∶32 000、10μg/mL和1∶8 000;正常、特异抗原批内变异系数分别为9.1%和5.8%,批间平均变异系数分别为8.8%和6.6%;检测灵敏度为1∶2 560;与犬细小病毒（CPV）、犬肝炎病毒（ICHV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于犬CDV抗体的检测。     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用简

目的：建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法：用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值（均值＋3标准差）。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果：在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72．14％（51/70）;69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98．6％（1/69）。结论：建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

两种HSV-1及猴B病毒相关抗体测定方法的比较

目的以人单纯疱疹病毒（HSV-1）做为抗原,利用空斑法和IFA法比较猴BV和人HSV-1阳性血清两种不同血清的中和能力的差异,建立一种实用、准确、可靠的病毒毒力的检测方法。方法首先,将HSV-1病毒悬液作连续的10倍稀释,取1 mL接种于已经长成单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数,算出病毒悬液中每毫升所含蚀斑单位,即滴定出HSV-1的TC ID50。同时,用免疫荧光方法（IFA）对猴和人疱疹阳性血清进行滴定,得到其血清的效价。其次,用滴定出的病毒液分别与两种阳性血清体外中和后,接种到单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数。最后,计算出其蚀斑减少率。结果用1%甲基纤维素作覆盖层的蚀斑数量平均为10-5PFU,能形成115-116个/mL蚀斑,形状呈黍米大小的规则圆形,其蚀斑边缘清晰。IFA滴定的人HSV-1阳性血清与猴BV阳性血清的中和抗体均为1∶80。人HSV-1和猴BV两种阳性血清的空斑减少率均为100%。结论确定了利用1%甲基纤维素做为覆盖层可得到清晰可靠的蚀斑,由此方法检测到用人HSV-1可以代替猴B病毒,筛查猴B病毒抗体。且为将来进行药物筛选和中和实验中利用病毒空斑法建立方便、可靠的方法。     

单克隆抗体酶联免疫吸附法检测尿标本中人巨细胞病毒抗原

本文运用抗人巨细胞病毒(HCMV)包膜20KD或/和130KD结构蛋白的单克隆抗体分别建立了4类酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法,共对44人份临床尿标本进行HCMV抗原检测。方法的敏感度可高达10.3—32.8ng HCMV抗原/ml尿,与尿标本中的HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ和EBV抗原无交叉反应,重复性良好,与病毒分离比较,敏感性和特异性在71—83％和88—100％之间;与核酸杂交比较,敏感性和特异性也可分别高达60—100％和83.3—100％。混合使用多种单克隆抗体作为包被抗体会得到较好的技术参数。上述结果提示运用单克隆抗体ELISA将有助于一般临床实验室对HCMV感染的快速诊断。     

儿童呼吸道肺炎支原体感染的实验室诊断

目的同时用目前常用的几种诊断肺炎支原体（MP）感染的实验方法检测MP,相互比较,得出适于常规诊断MP感染的方法或组合。方法搜集我院于2006年10月至2007年5月间以呼吸道感染入院儿童病例75例,采集其咽拭子和双份血清标本,以多种方法检测有无MP感染：培养法、EIA法测抗原、PCR法测MP-DNA,ELISA法测MP特异性IgG、IgA型抗体以及捕获法ELISA测MP特异性IgM型抗体。结果上述75例儿童中,共计有12例感染MP。以此为基础,上述各方法的敏感度分别是：培养法（25％）、EIA法测抗原（8．3％）、PCR法测MP-DNA（75．0％）、ELISA法测MP特异性IgA型抗体（单份血清为0,双份血清为33．3％）、捕获法ELISA测MP特异性IgM型抗体（单份血清为66．7％,双份血清为100％）。特异度分别是：100％、96．8％、93．7％（93．7％）、98．4％（98．4％）。PCR法和捕获法ELISA测MP特异性IgM型抗体结合后敏感度和特异度分别达到100％和95．2％。结论PCR法测MP-DNA和捕获法ELISA测MP特异性IgM型抗体的组合可高效地诊断MP感染,因而可作为临床诊断MP感染的一个常规组合。     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用

目的:建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法:用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值(均值+3标准差)。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果:在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72.14%(51/70);69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98.6%(1/69)。结论:建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

单克隆抗体夹心ELISA检测SARS病毒抗原的研究

目的:建立单克隆抗体(McAb)夹心ELISA法,用于检测SARS病毒(SARS-CoV)抗原。方法:用间接夹心ELISA法筛选捕捉和标记用单克隆抗体的组合,采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP),优化后用于检测SARS-CoV。结果:从12株抗SARS-CoV鼠单克隆抗体中筛选出2A3/1C5组合用于捕捉SARS-CoV,1A5/1B4组合标记HRP作为指示抗体。优化后2A3/1C5的最适工作浓度为1∶4000,HRP-1A5/1B4的最适工作浓度为1∶2000。本方法检测SARS-CoV的敏感度为105pfu/mL。结论:单克隆抗体夹心ELISA法可特异性检测SARS-CoV抗原。     

基于夹心免疫分析的抗体微阵列的构建

目的：建立一种基于夹心免疫分析的抗体微阵列构建的优化方法。方法：将MCP-1的捕获抗体点样于修饰后的玻片,标准抗原加样覆盖所点阵列,生物素标记抗体和链酶亲和素-cy3依次加样孵育, 激光共聚焦扫描仪获取图象并进行数据分析。对捕获抗体浓度、封闭液种类、系统可重复性和定量检测能力、两种因子平行性检测对信号分析的影响及点样后玻片稳定性进行分析和评价。结果：随着捕获抗体浓度的升高,信号强度逐渐增加;2℅ BSA/PBS和5℅ 酪蛋白可作为本系统的封闭液;所构建系统具有较好的可重复性（组内变异 1.3%,组间变异8.7%）和定量分析能力（所建立的抗原浓度-相对信号强度标准曲线相关系数达0.9995）;并实现了两因子的平行性分析和点样后玻片的稳定性。结论：确立了基于夹心免疫分析的抗体微阵列构建的优化方法,为进一步构建多因子定量检测抗体微阵列奠定了基础。     

R-ELISA: repeated use of antigen-coated plates for ELISA and its application for testing of antibodies to HIV and other pathogens.

In this paper we report on the evaluation of several procedures that allow for the repeated use of an antigen-coated, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plate for enzyme immunoassay (EIA). We have shown that antigen-coated ELISA plates that were incubated once with an aqueous solution containing 8 M urea, 2% sodium dodecyl sulfate and 2% mercaptoethanol, after an EIA, can be reused again for EIA without loss of antigenic capacity. Thus, in this procedure, after an EIA, the ELISA plates were washed once with the above solution and then in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% Tween 20 and 500 mM NaCl. This washing protocol was shown to remove the primary antibody, enzyme-conjugated secondary antibody and substrate without removing the antigen from the ELISA plate microwells. Thus, an antigen-coated ELISA plate previously used for an assay could be reused. We tested this repeat ELISA (R-ELISA) procedure on high antigen-binding ELISA plates coated with two different plant virus proteins, a synthetic peptide, the p25/24 gag and the gp120 proteins of the human immuno-deficiency virus, or the staphylococcus enterotoxin protein. In each case tested, the procedure allowed for the repeated use of the same antigen-coated plates for EIA of the respective antibodies. This procedure should prove to be particularly valuable for mass screening of samples tested for HIV and other disease-causing agents.     

Immunoenzyme analysis for determining class G and M antibodies to HBsAg

A scheme of the purification of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) as applied to the enzyme immunoassay (EIA) for the detection of antibodies to HBsAg is described. An indirect EIA technique for the detection of IgG and IgM antibodies to HBsAg has been developed and the diagnostic assay system based on the use of immunoreagents and solid-phase carriers produced in the USSR has been obtained. The sensitivity of the indirect EIA technique in the detection of IgG antibodies to HBsAg exceeds that of double immunodiffusion in gel used for this purpose 2,500- to 5,000-fold. The study has shown the possibility of using the indirect EIA technique for the detection of antibodies to HBsAg, both free and bound in immune complexes, of detecting antibodies to HBsAg in patients with acute and chronic viral hepatitis B, as well as of simultaneous detection of IgG and IgM antibodies to HBsAg without pseudonegative results.     

中缅树鼩自然感染六种病毒的血清流行病学

中缅树鼩作为一种新型实验动物,在医学生物学上,尤其是病毒学方面的应用受到越来越多的重视.实验动物自身病毒感染会影响动物健康和干扰实验结果,甚至危害实验人员生命安全.所以,实验动物病毒检测一直是动物质量控制的重要部分.中缅树鼩研究迄今缺乏清晰的病毒自然感染资料.为调查中缅树鼩的病毒感染状况,采集野生俘获和人工繁殖的中缅树鼩血清样本272份,全部血清样本通过ELISA方法对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原,丙型肝炎病毒(HCV)总抗体,以及戊型肝炎病毒(HEV)、腺病毒(ADV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)的IgG抗体进行了检测.结果表明,ELISA初筛HBV表面抗原有3份阳性样本,但通过乙型肝炎两对半定量检测进一步确认为阴性:抗HCV抗体和抗HEV、ADV、HSV-1 IgO抗体检测均为阴性;抗HSV-2 IgG检测有1份阳性样本.提示仪抗原或抗体血清学指标检测树鼩肝炎结果并不能反应个体携带病毒的状态,应该再进行病毒学指标确认.同时建议中缅树嗣繁殖群应进行HSV-2的筛选,以便杜绝和控制该病毒的感染.     

清洁级实验动物四种病毒抗体玻片酶免疫检测试剂盒的研制

本文报道对清洁级实验动物应排除的四种病毒（淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、小鼠脱脚病病毒、鼠肝炎病毒和仙台病毒）抗体玻片酶免疫（ＥＩＡ）检测试剂盒的研制。四种病毒感染的细胞和对照细胞经冷丙酮固定于载玻片上制成特异性抗原和对照抗原,此四种病毒的抗血清各１０份和ＳＰＦ小鼠血清２０份分别与四种病毒的特异性抗原和对照抗原进行ＥＩＡ交叉试验,结果显示,抗原只与其相应抗血清发生特异性显色反应,与非特异性小鼠血清和ＳＰＦ小鼠血清不显色。与ＨＩ或ＥＬＩＳＡ方法比较,通过对１１２份普通小鼠血清进行测试,结果表明,ＥＩＡ对仙台病毒抗体的检出率（１９．６％）显著高于（＜０．００５）ＨＩ（６．３％）,对小鼠脱脚病病毒抗体的检出率（２３．３％）与ＨＩ（２１．４％）无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。ＥＩＡ对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和鼠肝炎病毒抗体的检出率分别为１．８％和７１．２％,ＥＬＩＳＡ对两种病毒抗体的检出率分别为１．８％和６７．６％,两种方法对两种病毒抗体的检出率无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。重复性试验表明两批四种病毒抗体试剂盒对１０８份小鼠血清两次测定的符合率为９６～１００％。四种病毒的ＥＩＡ抗原在－１８℃保存１２个月或在２－８℃保存３     

小鼠脑脊髓炎病毒标准血清制备及间接ELISA检测方法的应用

目的制备小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）标准血清,建立ELISA检测方法,实现一种病毒多种检测方法的比对研究。方法用TMEV感染3周龄SPF级BALB／c小鼠,制备免疫用抗原。分别在0、7、14d以腹腔注射的方式免疫SPF级6-8周龄BALB／c小鼠,免疫血清用IFA、IEA法进行鉴定;TMEV感染BHK-21细胞,制备EHSA抗原,确定酶结合物、抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度,建立TMEVEHSA检测方法,进行敏感性、特异性、重复性和稳定性实验。结果制备TMEV免疫血清,以IFA、IEA测定血清效价分别为1：640和1：320,与痘苗病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒和呼肠孤病毒-Ⅲ型均无交叉反应;建立了ELISA检测方法,确立了各种试剂的最佳工作浓度,其中酶结合物最佳工作浓度为1：10000,抗原为2.5μg／mL,阳性参考血清为1：200;EHSA检测灵敏度为1：3200。板内特异抗原、正常抗原平均变异系数为4.67％和5.7％,板间为4.39％和7.61％。稳定性实验相对偏差均小于20％。结论本研究制备的TMEV免疫血清可作为血清学检测方法中的标准质控血清;建立的ELISA方法重复性、稳定性好,敏感性和特异性强,可用于小鼠脑脊髓炎病毒血清抗体检测。     

中山市2011年健康儿童脊髓灰质炎、麻疹和乙型肝炎抗体水平监测

目的了解中山市1~14岁健康儿童脊髓灰质炎(脊灰)病毒、麻疹病毒和乙型肝炎(乙肝)病毒抗体水平状况,为维持无脊灰、消除麻疹和控制乙肝提供依据。方法采用多阶段整群抽样方法,随机选择220名1~14岁健康儿童抽取静脉血,采用ELISA法检测麻疹病毒抗体Ig G、乙肝病毒表面抗原和抗体;用中和试验检测脊灰(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)型病毒中和抗体。结果脊灰、麻疹和乙肝病毒抗体阳性率分别为91.36%、93.18%和66.36%,脊灰病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型和麻疹病毒抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶215.90、1∶119.05、1∶31.40和1∶1 254.45;乙肝病毒表面抗原阳性率为1.36%。结论中山市1~14岁健康儿童对脊灰病毒具有较高的免疫水平,已形成对脊灰病毒有效的免疫屏障;乙肝得到有效控制;但麻疹未能形成有效的免疫屏障。     

Hepatitis A and B: serologic survey of human and nonhuman primate sera

Sera of humans and seven species of nonhuman primates were tested by radioimmunoassay and enzyme immunoassay for the presence of hepatitis A antibody, hepatitis B surface antigen and antibody to hepatitis B surface antigen. The outcome of testing a total of 276 serum or plasma specimens was as follows: with the exception of squirrel monkeys (0%) and cotton-top marmosets (0%), a considerable percentage of all other species tested had detectable antibodies to hepatitis A virus: humans 45.9%, chimpanzees 36.6%, baboons 38.2%, vervets 57.9%, cebus monkeys 40.0% and common marmosets 50.0%. Only one human and two chimpanzees were carriers of hepatitis B surface antigen. Antibodies to hepatitis B surface antigen were detected in human (11.3%), chimpanzees (29.9%), baboons (36.2%) and squirrel monkeys (5%). Chimpanzees showed an increasing prevalence of antibodies to hepatitis A virus and hepatitis B surface antigen with age.     

Diagnostic role of different immunologic methods for laboratory diagnostics of legionellosis

The aim of the study was a comparative analysis of diagnostic value of different laboratoty methods conducted on the basis of results of examination of patients during Legionnaires' disease outbreak in town Verkhnyaya Pyshma. Retrospective analysis of laboratory data from 74 patients with diagnosis of Legionnaires' disease was performed. Complex of laboratory methods was used (polymerase chain reaction (PCR), enzyme immunoassay (EIA), immunochromatography). In group of patients with Legionnaires' disease, the highest proportion of positive results (73%) was obtained by the EIA determining total specific antibodies in urine. Determination of antigen in urine by immunochromatographic express-test yielded 52% of positive results. PCR testing of blood specimens yielded positive results in 65% of samples but was low specific, due to that in 19% of patients from control group false-positive results were obtained. Testing of 3 autopsy samples showed that all specimens contained DNA of the causative agent. Performed analysis allowed to recommend complex use of immunochromatographic express-test of antigen detection and identification of total specific antibodies by EIA during mass people examination.