提高动物乳腺生物反应器表达水平的策略

在转基因动物乳腺生物反应器研究中,组织特异性表达水平、表达率和表达定位性是决定性的指标。因此,高效表达乳腺生物反应器的制备是许多研究者要实现的目标,也是走向产业化的基本要求。本文从基因构件、动物基因转移方面叙述了如何提高乳腺生物反应器表达水平、增强表达特异性及表达率,着重探讨如何提高动物乳腺生物反应器表达水平。     

小鼠β-酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺的表达

为验证克隆的小鼠β－酪蛋白基因序列调控外源基因表达的能力,将人人t-PA突变体基因的信号肽－前肽编码序列用小鼠β－酪蛋白的信号肽编码序列替换,人t-PA突变体成熟肽cDNA融合到小鼠β－酪蛋白基因的第2外显子中,从而构建成旨在应用小鼠β－酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺中表达的载体。融合基因经显微注射到小鼠的受精卵中,285枚注射的受精卵移植到13只受体小鼠,经PCR和Southern杂交鉴定,42只出生小鼠中有12只为转基因阳性鼠。7只转基因阳性鼠乳汁中表达人t-PA突变体,最高表达水平为3．6593μg/ml,证明小鼠β－酪蛋白基因序列能够调控人t-PA突变体基因在转基因小鼠的乳汁中表达出具有生物活性的人t-PA突变体,为进一步制备了人t-PA突变体基因敲入小鼠模型提供了理论和实验依据。     

转基因小鼠乳腺表达G-CSF的研究

用PCR法从正常中国人脐带血提取总DNA作为模板,扩增出1.5 kb的人G-CSF基因组基因。序列分析证实其正确性。将其插入小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的起始密码子ATG前的KpnⅠ位点,使其受控于2.6kb的WAP调控序列,构建成乳腺表达载体pWGG。回收经EcoRⅠ酶切后的8.7kb片段用于显微注射。共注射1200枚受精卵,移植34受体母鼠,产仔鼠85只。经PCR检测和DNA印迹分析,证实获得两只整合有人G-CSF基因的雄性鼠,整合率为2.37％。建立的转基因鼠系表明,采用ELASA方法对F1代雌鼠乳汁检测,成功地表达出人G-CSF。表达量为120～250ng/ml。这一结果表明转基因的表达具有乳腺特异性。这为在大动物中实施转基因提供了依据。     

转基因动物的乳腺表达

转基因动物乳腺组织特异性表达异源基因是近年来基因工程中引人注目的途径.文章介绍了这一途径有关的乳汁蛋白基因、乳汁蛋白基因与异源基因的融合方式、重组基因的必要构成以及可能影响高效表达的因素.     

转基因小鼠乳腺表达人胰岛素基因的研究

转基因动物乳腺生物反应器表达和生产医用蛋白是国际上的研究热点,目前已有很多成功的转基因动物乳腺表达出外源蛋白质［１］。在转基因动物乳腺表达的蛋白质包括凝血因子Ⅸ、组织纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）、α１抗胰蛋白酶原、白介素２、蛋白质Ｃ、超氧化物歧化酶...     

转基因动物乳腺暂时性表达系统的建立

以乳清酸蛋白(WAP)基因5′区为调控序列,人基因组G-CSF基因为目的片段,同时将WAP基因第一内含子插入G-CSF基因5′端,构建成转基因动物乳腺表达载体。将其直接注射到小鼠乳腺,在泌乳期表达出人G-CSF。表明乳腺直接注射质粒的方法可以做为暂时性的一种表达系统,同时也表明内含子对表达有一定的作用。     

转基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究

利用转基因动物乳腺生产药用蛋白质是近年来研究的热点,在这方面已有不少成功的例子,展现出良好的应用前景[1,2].本研究选择人瘦蛋白基因作为目标基因是因为其表达产物瘦蛋白能对人体内脂肪的蓄积和能量消耗进行有效的反馈调控,美国科学家已将用E.coli表达的人瘦蛋白用于人肥胖症的治疗并取得了良好的治疗效果[3],但尚未见到利用转基因动物乳腺表达这种蛋白质的研究报道.     

乳腺注射法表达人组织型纤溶酶原激活剂的研究

目的 :构建tPA乳腺定位表达载体 ,使其在牛乳汁中高效表达 ,观察目的基因表达的规律及其影响因素 ,为建立新型牛乳腺生物反应器提供理论基础。方法 :RT-PCR法克隆目的基因 ,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含tPA-cDNA的乳腺定位表达载体 ;采用乳腺注射法将融合基因转入小鼠及牛的乳腺组织中。结果 :乳腺注射外源基因后 ,tPA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 :乳腺注射法可使目的基因在乳腺组织中稳定地表达较长的时间 ,其表达量与显微注射法没有明显的差异 ,表明外源基因的表达不受转基因方法的影响。但tPA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量 ,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异 ,可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

HBD-3基因的乳腺特异性表达载体的构建及真核表达

为了制备高效表达人β-防御素-3基因的转基因奶牛提供可靠的核移植供体细胞,本试验采用RT-PCR从人胎盘组织获得人β-防御素3cDNA,通过双酶切法将目的基因片段hBD插入到质粒pBCP之间,最后再通过双酶切法将目的片段BCD插入到真核表达载体pEGFP-C1中,最终构建乳腺特异性表达载体pEBCD。脂质体介导法转染奶牛胎儿成纤维细胞G418,抗性筛选3~4周后,经PCR、RT-PCR扩增检测和报告基因EGFP表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞;同时检测稳定转染的奶牛乳腺上皮细胞系的上清液,检测到重组人β-防御素-3蛋白可以在奶牛乳腺上皮细胞组织特异性表达。     

重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测

人组织纤溶酶原激活剂(ht-PA)是临床血栓疾病治疗的主要生物药品,应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有报道,但重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人t-PA的F、E、K1区位点缺失体为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rh PA,通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。用PCR检测及其产物测序筛选转基因兔,ELISA试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔5只(2♂,3♀),其中2只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂,rh PA浓度最高可达400μg/m L,表达产物比活性是现有阿替普酶的150-200倍。实验结果表明,重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)可以在山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子调控下获得乳腺特异性表达,表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。