乳腺生物反应器的表达优化策略

乳腺生物反应器是指将外源基因导入动物基因组并在动物乳腺中特异性表达,利用动物乳腺合成、分泌蛋白的功能,在其乳汁中获得外源蛋白的技术。乳腺生物反应器凭借其高表达、低成本以及合成蛋白质的结构接近天然蛋白质等优势而被视为药用和营养蛋白生产的一次技术革新,然而由于外源基因随机整合以及重组蛋白表达不稳定等问题极大地限制了其应用。本文结合乳腺生物反应器的发展现状,从利用基因编辑技术、筛选合适的外源基因整合位点以及改进外源基因调控序列3个方面对乳腺生物反应器优化策略进行了综述,以期为提高乳腺生物反应器生产重组蛋白的表达提供理论借鉴。     

利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白

动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达,并从转基因动物奶液中获取重组蛋白。应用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白具有生产方式简单,产量大,蛋白能进行翻译后修饰等优点,是具有广阔前景的生物医药产业。本文仅就动物乳腺生物反应器的建立、检测、目的蛋白的分离纯化以及存在的问题等作一综述。     

动物乳腺生物反应器的现状和趋势

利用转基因家畜的乳腺生产人类重组蛋白,可以高效获得安全、足量的药用蛋白。本文针对乳腺生物反应器的成功研制,从目的基因的选择、载体构建、转基因技术等方面探讨了动物乳腺生物反应器的研究现状。分析了提高转基因效率和外源蛋白表达水平的技术途径,提出了降低总体成本的战略措施。特别探讨了利用Cre-loxP系统发展“体细胞打靶体细胞核移植技术体系”,高效生产乳腺生物反应器动物的可能性。     

猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1.经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定.结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1.乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础.     

体细胞基因打靶制备动物乳腺生物反应器的策略与应用

在转基因动物研究中,由于基因表达调控元件的人工拼接和外源基因在动物基因组中随机整合所带来的“位置效应”,致使转基因动物外源基因的表达水平不高并且差异较大。为此,利用定位整合优势,对以基因同源重组为基础的基因打靶技术进行了大量研究。介绍了就利用体细胞基因打靶和核移植技术制备动物乳腺生物反应器的策略和应用情况做一综述,并对提高基因打靶效率的各种策略,打靶细胞的选择,转基因细胞核移植的低融合事件以及基因打靶制备乳腺生物反应器的优越性进行分析。     

建立外源基因乳腺组织特异性表达快速检测系统的探索

乳腺生物反应器研制是近年来生物工程领域的研究热点,有效的乳腺组织特异性表达载体的构建则是该工作的关键。为了验证外源基因乳腺组织特异性表达载体构建的合理性和有效性,我们实验室探索利用重组逆病毒（retrovirus）、重组腺病毒（adenovirus）和SA脂质体（SAliposome）为介导,将外源基因及其表达构件导入活体奶山羊的乳腺组织,建外源基因乳腺组织表达的快速检测系统;取得了较为理想的效果。     

制备动物乳腺生物反应器的问题和对策

动物乳腺是理想的用于生产复杂的生物活性蛋白的生物反应器。目前,显微注射仍然是制备大型转基因动物的主要方法,但外源基因整合效率低下和位置效应还需要解决。要解决这两个问题,人们探索了几种策略。尽管使用转染的体细胞和基因打靶的体细胞作为核移植的供体的动物克隆技术还在改善中,但是这一技术是有应用前景的转基因牲畜的方法。在转基因载体中使用LCR和MAR序列可显著提高表达水平和转基因效率。YAC、BAC作为理想的转基因载体可能因为它们能容纳基因座的所有元件。虽然这些技术和方法还存在不完善之处,但其发展将极大地提高动物乳腺生物反应器的整合率和表达水平。     

人凝血IX因子基因乳腺组织特异性表达载体的构建及其在奶山羊乳腺中的分泌性表达

血友病B(Hernophilia B)是由于人凝血IX因子(hFIX)缺乏所致的一种严重出血性疾病。常规治疗方法是通过输血或输入人浓缩凝血IX园子来实现的,因此患者很容易被肝炎病毒甚至爱滋病毒感染。近年来,人们期望通过转基因动物乳腺表达并从乳汁中分离生产hFIX蛋白,以解除血友病患者的痛苦。以转基因动物的乳腺组织即乳腺生物反应器生产外源蛋白具有原核生物,酵母以及离俸真核细胞生产系统所不具备的优点：生产的外源蛋白经过体内加工和修饰,特别是真核蛋白的转译后加工(如糖基化和羧基化)．其生化特性、生物学活性与天然蛋白完全相同^[1];另外从乳汁中生产外源蛋白不需要复杂的工厂设备。因此开展人凝血IX因子乳腺生物反应器的研究具有重要的经济意义和临床应用价值。转基因动物乳腺生物反应器的关键在于外源基因乳腺组织特异性表达载体的构建。我们利用小鼠MAR元件(Matrix attachment regions)．牛的β-casein基因调控顺序,hFIX mini-gene和hFIX cDNA分别建成两种乳腺组织特异性表达载体pMCIXm和pMCIX,经SA脂质体包埋载体DNA后直接转染奶山 羊乳腺小叶,hFIX蛋白在奶山革乳汁中获得瞬间分泌性表达,最高表达量为13.7ng/ml乳汁。其中含hFIX mini-gene的表达载体在奶山羊乳汁中的表达量高于含hFIX cDNA的表达载体．表明hFIX的in-tronl能够提高该基因在活体奶山羊乳腺中的表达。A7单抗和柠檬酸钡吸附检测表明乳汁中的hFIX 蛋白羧基化和活性比率都在90％以上。以上结果肯定了载体构建的正确性．不但为研制hFIX蛋白乳腺生物反应器提供了有效的表达载体,同时也表明利用阳离子SA脂质体包埋质粒DNA直接转染活体物乳腺可以作为验证乳腺表达载体构建正确性的快速检测手段。     

乳腺生物反应器表达载体的检测方法

乳腺生物反应器研究和开发的周期长 ,成本大 ,风险高 ,在生产转基因动物之前有必要对乳腺特异性表达载体构建的合理性和有效性进行检测。综述了国内外载体检测研究的进展 ,以及这些检测方法在转基因小鼠、动物乳腺内表达法和细胞培养中的应用     

乳腺生物反应器实用化研究-现状与问题

转基因家畜的乳腺有可能作为生物反应器来生产具有生物活性的多肽药物和具特殊营养意义的蛋白质。一个新兴的转基因动物制药业已开始崛起。用乳汁蛋白质基因的调节元件不仅有可能使转基因的表达只限于乳腺组织,而且有可能使转基因表达产物得到高水平表达和大量生产。各种酪蛋白,以及乳清蛋白和乳球蛋白等基因的调节元件已相继被克隆和投入使用。已经有多种具有生物活性的昂贵的医用蛋白质在乳腺组织中合成并分泌。迄今,转基因动物的研究明确了在乳蛋白基因启动区域上游区的一些乳腺特异和激素诱导转录元件,细胞系和原代培养细胞的转染的研究鉴别了一些组成性和激素诱导的因子。但转基因随机整合造成的“位置效应”所引起表达结果的不确定性,限制了乳腺生物反应器产业化的形成和发展。由于乳汁蛋白质基因的表达都具有典型的时空特异性格式,乳蛋白基因的表达受到了激素和发育调节的转录因子的综合调控。为使乳腺反应器的应用更卓有成效和得心应手,我们尚需对它的发育和激素调控密切相关的生理学和染色体座位具备充分了解。     

药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展

用乳腺生物反应器生产人类珍稀的药用蛋白已经构成了现代生物技术的一个重要领域.与其他的生物工程方法比起来,用乳腺生物反应器生产人类珍稀的药用蛋白具有更多的优点.这一生物技术的实际应用依赖于基因的时空表达调控操作和可靠的转基因动物制作方法.综述了这一技术的优点,概括描述了了乳腺生物反应器表达载体的构建方法,及转基因动物的制作方法.讨论了这些方法的优缺点及技术改进的发展方向,特别是介绍了最近出现的、有研究和应用价值的用精原干细胞制作转基因动物的方法.     

人促血小板生成素在转基因小鼠乳腺中定位表达的研究

通过转基因动物乳腺生物反应器大规模生产药用蛋白质已成为现代生物技术新的生长点之一。为研制表达人促血小板生成素的哺乳动物生物反应器的转基因小鼠模型,本论文以小鼠乳清酸蛋白（mWAP)基因5‘端调控区和牛α-sl-酪蛋白基因3‘端调控区作为调节元件构建了用于表达人促血小板生盛开纱的乳腺组织特异性表达载体pWAPTPO(Fig.l)。通过常规显微注射的方法把mWAP启动子指导的hTPO表达载体导入小鼠受精卵,获得出生小鼠16只,经PCR检测,有6只为转基因阳性（Fig.2)。G0代小鼠中转基因整合率为37.5%(6/16),用ELISA方法在G0代转基因雌鼠的乳汁中检测了促血小板生成素的表达,表达量在0.8μg/mL以上（Tablel)。这些结果表明我们已建立了乳腺表达hTPO的转基因小鼠模型,为以后大型家畜乳腺生物反应器的研制提供了科学依据。     

转基因小鼠乳腺上皮细胞的体外培养及其对催乳素反应的研究

实现转基因生物乳腺反应器对外源蛋白的高效表达是目前生物制药亟待解决的难题。催乳素对泌乳期乳蛋白的合成与分泌具有重要的调控功能。通过转基因小鼠乳腺上皮细胞模型的建立,研究催乳素如何调控乳蛋白的表达,为提高乳腺反应器高效表达外源蛋白提供技术及理论支撑。应用机械破碎及胶原酶消化法,经差速贴壁纯化,成功培养含人转铁蛋白基因的小鼠乳腺上皮细胞,细胞上清液中检测到人转铁蛋白表达。细胞经牛催乳素诱导后人转铁蛋白的表达水平明显升高。利用转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,可以进行催乳素和环境因素等对乳腺上皮细胞合成及分泌蛋白能力影响的研究。     

乳腺生物反应器的研究现状

乳腺生物反应器是将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达,以转基因动物的乳腺组织生产药用蛋白。采用乳腺生物反尖器生产药用蛋白质是一种全新的生产模式,它已经成为生物技术领域发展的重要方面。乳腺生物反应器具有能够生产出具有完全生物活性的药用收白,纯化简单,投资少,成本低,对环境没有任何污染等优点,转基因动物生产药用蛋白可以获得巨额经济效益。     

乳腺生物反应器的产业化进展与展望

进入21世纪,伴随着转基因技术的快速发展,转基因动物的研究已经从方法学研究步入了应用性研究阶段。外源基因在转基因动物的特异性表达,尤其是在乳腺的表达,可将转基因动物用作生物反应器进行生物活性蛋白的生产而应用于商业生产。生产出来的药用蛋白具有纯化简单,投资少,成本低,对环境没有任何污染等优点。用转基因动物生产药用蛋白可获得巨大的经济利益,因此成为国内外研究的热点。     

乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区（pBLG）表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法：构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ（pCAG-loxP-PolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ）。转染细胞实验结果：PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞（HC11）中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论：构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。     

乳蛋白调控元件和乳腺表达载体的研究进展

利用转基因动物乳腺生物反应器生产重组蛋白是一项极具潜力和开发价值的生物技术,但成功的例子并不多,主要是由于乳蛋白的表达调控机制还未完全阐明,构建的表达载体不足以克服位置效应的影响,使得外源基因的表达难以预期。目前乳腺生物反应器研究的热点是对乳蛋白表达调控元件进行更深入的研究,构建基于酵母人工染色体、细菌人工染色体的经过修饰的乳蛋白基因座载体。简要综述了乳蛋白表达调控元件和表达载体的研究进展。     

动物乳腺生物反应器的应用与展望

应用转基因技术生产乳腺生物反应器可以获得高效、安全、足量的人类重组蛋白、药用蛋白及其目的蛋白.本文概述了制备转基因动物过程中目的基因选择、载体构建等技术环节的研究现状;通过叙述乳腺生物反应器的原理和应用现状来分析乳腺生物反应器的优势及特点,为乳腺生物反应器的发展和应用奠定理论基础.     

乳腺生物反应器的研究现状和产业化前景

转基因动物乳腺生物反应器是伴随转基因动物技术而发展起来的一项高新生物技术。利用这项技术,我们可以从动物乳汁中源源不断地获取用于医疗或保健目的的有生物活性的基因产物。这是一种全新的蛋白质生产模式,它将成为许多国家的重要支柱产业之一。本文介绍了乳腺生物反应器的基本概念和基本原理;概述了制备过程中的目的基因选择、载体构建、转基因等技术环节的研究现状;分析了乳腺生物反应器的优势及存在的问题,并就其产业化前景进行了展望。     

转基因小鼠乳腺表达人胰岛素基因的研究

转基因动物乳腺生物反应器表达和生产医用蛋白是国际上的研究热点,目前已有很多成功的转基因动物乳腺表达出外源蛋白质［１］。在转基因动物乳腺表达的蛋白质包括凝血因子Ⅸ、组织纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）、α１抗胰蛋白酶原、白介素２、蛋白质Ｃ、超氧化物歧化酶...