条件基因打靶研究存在的主要问题及对策

基于Cre-loxP等位点特异性重组系统的条件基因打靶技术在解析基因功能和制备疾病小鼠模型方面发挥着极其重要的作用。但包括Cre重组酶转基因的表达模式不理想、重组效率存在差异、Cre重组酶的毒性等在内的Cre-loxP重组系统相关的缺陷以及条件基因打靶技术本身存在的问题,如遗传背景、育种策略、实验对照、基因代偿等方面的影响往往被忽略,严重影响基因功能和小鼠表型解析的准确性。针对这些问题,精细调控实现Cre重组酶的理想时空特异性表达、详尽地分析Cre重组酶的重组效率、降低Cre重组酶的毒性、遗传背景单一化、优化育种策略、设立严格实验对照、多基因联合条件基因打靶等诸多解决方案应予以采纳。     

血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

血管内皮细胞参与血管形成、血管稳态维持、血栓形成、炎症和血管重建等生理和病理过程。为了便于通过Cre-LoxP系统研究相关基因在血管内皮细胞中的功能,创建了Tie2-Cre转基因小鼠,利用Tie2基因的启动子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细胞中表达。经基因组PCR和Southern Blot鉴定有6只小鼠在基因组上整合有Cre基因,整合率为11％。为了验证Cre重组酶的剪切活性和表达组织分布,我们将Tie2-Cre转基因小鼠分别与Smad4条件基因打靶小鼠和报告小鼠ROSA26交配。Tie2-Cre;Smad4^co/＋小鼠的多个组织的基因组DNA的PCR结果显示,Cre重组酶在所有包含血管内皮细胞的组织中表达并能介导LoxP间的重组。Tie2-Cre;ROSA26双转基因胚胎LacZ染色结果显示,Cre重组酶在所有被检测组织的血管内皮细胞中特异性表达。因此．Tie2-Cre转基因小鼠可作血管内皮细胞谱系分析和在血管内皮细胞进行条件基因打靶的理想工具小鼠。     

Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性条件敲除研究的关键。采用PCR扩增大鼠胰岛素基因705bp启动子指导发胰岛细胞中特异表达;同时采用改构的Cre重组酶基因,在其5'端添加有真核核糖体结合序列和核定位序列使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核能发挥功能;同时,为了保证原核基因Cre能在真核系统顺利表达,在其3'端添加含内含子的人生长激素基因。构建的表达载体在去除原核序列后用显微注射方法转基因小鼠,在出生的27只仔鼠中,PCR检测共获得7只Cre整合阳性的转基因小鼠,整合率26％。这种Cre转基因小鼠与基因组小携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配,在胰腺组织中可以检测到Cre介导的重组,表明Cre在转基因小鼠胰腺中有表达。     

表面活性蛋白A启动子指导Cre重组酶在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中表达

Ⅱ型肺上支细胞合成和分泌肺表面活性物质（PS）,与肺损伤后的修复有关,很多肺相关疾病的发生伴随有Ⅱ型肺上皮细胞功能不全及PS系统缺陷。Ⅱ型肺上皮细胞在肺的发育、机体免疫及疾病的发生发展过程中的具体功能尚不明确．对调控Ⅱ型肺上皮细胞功能的遗传机制也知之甚少。为了利用Cre-loxP系统研究调节Ⅱ型肺上皮细胞功能的遗传机制,研制了表面活性蛋白A（SP—A）启动子指导Cre重组酶基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中表达的转基因小鼠。将整合有Cre重组酶基因的首建者小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠及ROSA26报告小鼠交配,利用基因组PCR和LacZ染色检测Cre重组酶表达的组织分布及其钵内介导loxP位点间重组的活性。多组织基因组PCR显示Cre重组酶在转基因小鼠肺、脑和消化道组织中表达。LacZ染色显示仅在Ⅱ型肺上皮细胞中检测到Cre重组酶的活性。以上结果表明本研究研制的pSP—A—Cre转基因小鼠可用于在Ⅱ型肺上皮细胞中进行条件基因打靶和细胞谱系分析。     

角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有角质细胞特异性角质素5启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因plyA的转基因载体pK5-Cre-hGH。以显微注射的方法将4．2kb的转基因片段K5-Cre-hGH引入小鼠基因组,共注射720枚受精卵,其中龄5枚移植至29只假孕母鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠48只,经基因型鉴定有12只小鼠在其基因组上整合有Cre基因,整合率为25％。将带有cre重组酶基因的小鼠与基因组上携带loxP位点的smad4条件基因打靶小鼠杂交以检测Cre重组酶组织特异性表达情况以及介导重组的功能。结果表明,K5-Cre转基因小鼠只在皮肤组织中表达Cre重组酶并能在体内成功地介导loxP位点的重组。     

基于BAC重组酶系统构建莱航鸡多位点基因打靶载体的研究

以莱航鸡重复的rDNA基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC—TDN筛选我体和pYLVS-GID表达我体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过其Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GID质粒,采用归位内切酶I-SeeⅠ切除pYLVS质粒骨架,利用接头塔使之环化,构建成莱航鸡大容量多位点基因打靶载体BAC-TDN—GID。每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。以该载体为材料的多位点基因打靶技术将提高基因定点整合效率,解决外源基因不能稳定表达、安全性等部分问题,突破了DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。     

基于BAC重组酶系统构建莱航鸡多位点基因打靶载体的研究

以莱航鸡重复的rDNA基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GID表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过其Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GID质粒,采用归位内切酶I-SceⅠ切除pYLVS质粒骨架,利用接头LS使之环化,构建成莱航鸡大容量多位点基因打靶载体BAC-TDN-GID。每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。以该载体为材料的多位点基因打靶技术将提高基因定点整合效率,解决外源基因不能稳定表达、安全性等部分问题,突破了DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。     

软骨组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的研制和鉴定

构建了含有软骨组织特异性Ⅱ型胶原A1启动子和Cre重组酶基因的转基因载体pcol2Al-Cre。323枚小鼠受精卵经显微注射引入转基因片段后,分别移植至14只假孕母鼠的输卵管使其发育。共得到仔鼠52只,PCR结果显示其中10只小鼠基因组上有Cre基因的整合,整合率为19．2％。用整合有Cre基因的转基因小鼠与基因组上携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配,以检测Cre酶介导的重组及其组织特异性。PCR结果表明：col2Al-Cre转基因小鼠软骨组织中表达的Cre重组酶成功地介导了LoxP之间的重组。此结果通过Southern杂交得到了进一步的证实。     

基于Cre重组酶体系的鸡卵清蛋白基因打靶载体的构建

利用胚胎干细胞基因打靶技术制备转基因鸡是研制鸡输卵管反应器的最佳技术路线。为建立基于Cre/loxp系统的鸡卵清蛋白基因(Ovalbumingene,OV)位点的双交换打靶载体系统,本研究克隆了鸡的OV基因7.8kb片段,并与克隆的内部核糖体进入位点(IRES)、人工合成的含有Cre重组酶识别位点变异体交换盒m2/loxp71EGFPloxp66,一起构建了含有Hsvtk负筛选标记的针对鸡卵清蛋白基因位点的敲入型共表达基因打靶载体pSSCm2/71EGFP66IRESOV7.8;以猪β干扰素基因(βInterferon,IFNβ)为目的基因构建了穿梭载体pMDm2/66MCSIFNMCSLoxp71,经过限制酶酶切及部分测序鉴定,所构建载体结构正确。进一步将它们共转化组成性表达Cre的细菌BM25.8,验证了loxp突变位点对重组反应的有效性     

消化道细胞表达Cre重组酶转基因小鼠的功能鉴定

目的:检测白蛋白启动子介导的Cre重组酶转基因小鼠Alb-Cre-2中Cre重组酶的组织分布及其在体内介导基因重组的作用。方法:将Alb-Cre小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠交配,利用PCR对Cre重组酶介导重组的组织特异性进行检测;然后,将Alb-Cre-2转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配,利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测。结果:PCR结果显示心、肺、胰、脑及消化道中Cre重组酶介导的Smad4基因发生重组;LacZ染色进一步表明Cre重组酶在肝细胞、胃壁细胞、空肠潘氏细胞、回肠杯状细胞、大肠杯状细胞、大肠柱状细胞及空泡细胞中特异性表达,并介导ROSA位点LoxP序列间的重组。结论:Alb-Cre-2转基因小鼠在消化道中具有一定的组织特异性,只在胃壁细胞、空肠潘氏细胞、回肠杯状细胞、大肠杯状细胞,大肠柱状细胞及空泡细胞等细胞类型中特异性表达,并能在体内成功地介导这些消化道上皮细胞基因组上LoxP位点间的重组,是一种研制在消化道特定细胞中特异性基因剔除小鼠的良好工具小鼠。     

基于BAC重组酶系统构建莱航鸡多位点基因打靶载体的研究

以莱航鸡重复的rDNA 基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GID表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过其Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GID质粒,采用归位内切酶I-SceⅠ切除pYLVS质粒骨架,利用接头LS使之环化,构建成莱航鸡大容量多位点基因打靶载体BAC-TDN-GID。每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。以该载体为材料的多位点基因打靶技术将提高基因定点整合效率,解决外源基因不能稳定表达、安全性等部分问题,突破了DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。     

特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的方法

利用组织特异性分子标志物启动子调控Cre重组酶,研制了6种在不同组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠.这些转基因小鼠的基因型鉴定均使用设计在Cre基因编码区的通用引物.为了特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶的转基因小鼠,在大鼠胰岛素RIP启动子上和Cre基因上设计1对引物进行PCR扩增,并通过凝胶电泳进行分析.PCR结果显示,设计在Cre基因上的通用引物可以从6种不同组织特异性Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增获得480 bp产物;利用本研究设计的特异性引物可以从胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增200 bp的目的条带.这一结果表明,利用特异性引物进行PCR反应,可有效地将胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠与其他多种组织的Cm重组酶转基因小鼠鉴别开来.     

胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性基因剔除研究的重要工具。为了建立胰腺组织特异性Cre转基因小鼠,我们通过PCR克隆了大鼠胰岛素基因启动子,并用它指导Cre基因在胰岛细胞中的特异性表达。在Cre重组酶基因5′端添加了真核核糖体结合序列和核定位序列以使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核中发挥功能;同时,在Cre基因3′端添加了含内含子的3′端人生长激素基因。表达载体经显微注射导入小鼠受精卵以建立转基因小鼠。PCR检测显示共获得7只Cre整合阳性的转基因首建者小鼠;RTPCR结果表明其中1只首建者小鼠的子代鼠在胰腺中转录了外源基因,进一步的Southern杂交结果表明,该转基因小鼠能够在胰腺中表达有功能的Cre重组酶。      

植物的基因打靶

对拟南芥、苔藓等几种模式植物基因打靶的研究新进展作了概述,并对目前基因打靶领域的一些新技术(如含有重组酶和稀有限制性内切酶的基因打靶载体技术、异源重组基因的过表达技术、参与重组酶的基因突变技术、寡核苷酸诱导的基因打靶技术等)作了介绍.     

Cre/lox位点特异重组系统在转基因植物中的应用

位点特异重组系统由重组酶和相应的重组酶识别位点组成,通过两者间的相互作用,实现外源基因精确整合与切除等一系列遗传操作.主要可分为Cre/lox系统、FLP/frt系统、R/RS系统和Gin/gix系统.目前,研究最充分应用最广泛的位点特异重组系统为Cre/lox系统.此系统为位点特异重组系统家族中的一员,由38.5kDCre重组酶和34bplox位点组成,最早被应用于动物转基因研究,包括基因敲除、基因激活、基因易位等.近年来,随着研究的深入,Cre/lox系统被逐步应用到植物研究中,并在诸多领域取得重大进展.本文总结归纳了Cre/lox系统在定点整合、定点切除以及叶绿体转化等方面的最新研究成果,旨在为利用Cre/lox系统构建环境安全和高效表达的植物遗传转化体系提供参考.     

干扰素诱导Mx—Cre转基因小鼠表达的重组酶活性的体外检测

利用PCR、Western blot、免疫组化、免疫金标电镜、Southern blot从DNA水平,蛋白水平分析干扰素诱导后Mx-Cre转基因小鼠肝组织中Cre重组酶的表达及其表达产物的活性,在对Mx-Cre转基因小鼠基因组中整合有cre基因进行确定后,通过干扰素诱导Mx-Cre转基因小鼠表达Cre重组酶,结果表明转基因小鼠肝细胞核和细胞质中均有Cre重组酶的表达,并在超微水平进一步证实,将含表达的Cre重组酶的肝细胞核抽提液加入到带有loxP位点的DNA中进行重组,分析证明Mx-Cre转基因小鼠表达的Cre重组酶具有重组活性,从而建立了体外检测Mx-Cre转基因re重组酶活性的方法。     

细胞可透过性Cre重组酶表达、纯化及生物活性检测(英)

Cre/lox P系统由Cre位点特异重组酶和可被Cre特异性识别的lox P位点构成,该系统广泛用于条件性基因敲除和表达,以研究基因功能.为了表达和纯化一种细胞可透过性Cre重组酶(即His6-NLS-Cre-MTS);经IPTG诱导,在BL21(DE3)宿主菌成功表达His6-NLS-Cre-MTS融合蛋白,通过His-Bond Ni-NTA树脂分离并纯化了该蛋白质,随后借助细胞和非细胞的重组系统成功检测了His6-NLS-Cre-MTS的生物活性.细胞可透过性Cre重组酶提供了一种快捷而高效的在细胞和在体水平进行遗传操作的新工具.     

pSH-CUP重组质粒的构建及面包酵母酸性海藻糖 酶基因的敲除

设计含有与面包酵母(Saccharomyces cerevisiae BY-6)编码酸性海藻糖酶ATH基因内部部分序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除单元,转化面包酵母获得G418阳性克隆.将铜抗性基因(cuP1-MT1)导入Cre重组酶表达质粒pSH47,得到重组质粒pSH-CUZ,并转化阳性克隆,以铜抗性筛选面包酵母转化子.半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因.重组质粒pSH-CUP的构建,不仅解决了酵母转化子筛选标记问题和非酵母基因的引入,而且使LoxP-kanMX-loxP基因敲除体系在进行真核生物基因敲除时更加方便可行.     

Cre/loxP介导的伤寒杆菌染色体上插入基因的切除

来源于P1噬菌体的位点专一性重组系统loxP/Cre,已成为一种新的DNA操作的有用工具,在体内外都获得了成功的应用.为了将四环素诱导表达系统引入减毒伤寒杆菌CVD908株中,tetR-loxP-neo串联基因已通过同源重组被定位插入在CVD908株的△aroC位点中.构建一Cre酶表达受启动子P_LtetO-1控制的自杀质粒pJG9/Cre,以切除CVD908株△aroC中同向loxP序列之间的neo基因.质粒pJG9/Cre电转化入菌中,加入去水四环素诱导Cre酶表达,通过重组切除neo基因,再通过自杀质粒上SacB基因的启动,使质粒清除出菌细胞.抗生素鉴定和PCR扩增都证明,CVD908株△aroC位点中的neo基因被成功切除.     

Cre-LoxP条件性基因敲除的实际应用策略

Cre-loxP系统是起源于P1噬菌体的高效重组系统,其根据loxP位点组合不同而发生特定重组的模式使其成为近年来基因编辑最常用的工具之一。本文聚焦于Cre-loxP系统的实际应用问题,首先分析了CRISPR/Cas9系统在插入Cre序列与loxP序列中的作用与优势,随后阐述了一系列Cre-loxP系统的实际应用问题。本文阐述了Cre重组酶序列的原位插入与安全位点插入的选用、loxP序列插入的策略、Cre重组酶的标签蛋白鉴定、“异位”表达的荧光鉴定、PCR鉴定法的引物设计与工具鼠的繁殖策略等。同时,介绍了Cre-loxP系统在条件性基因敲除中的优化应用,例如配体诱导型Cre、启动子激活型Cre、光诱导型Cre与活性改造型Cre等。通过这些优化应用,可以获得对条件性基因敲除的时间可控性,也可以调节Cre重组酶的活性,甚至可以规避Cre重组酶本身的毒性。最后,论述了Cre-loxP系统面临的缺陷与挑战,展望了未来Cre-loxP系统的发展方向。总而言之,本文综述了基于Cre-loxP系统的基因敲除的实际应用,总结了目前Cre-loxP系统最前沿的研究进展和优化策略,并对未来基于Cre-loxP系统的基因编辑进行展望。本文旨在提供解决基于Cre-loxP系统实际操作问题的理论指导,并为未来更精确、更可控、更具适应性的基因编辑提供新的研究思路。