文库筛选与分子进化的核糖体展示新方法

利用适当的文库筛选技术快速、简便地从DNA文库、随机肽库、抗体库或其它蛋白文库中筛选生物活性物质是目前分子生物学研究的一个热点.核糖体展示是一种完全离体进行的功能蛋白筛选和进化鉴定的新技术,避免了传统的活体筛选技术的缺陷,使得文库容量增大、分子多样性加强.本文系统地评述了核糖体展示技术在制备ScFv单链抗体方面的应用,包括ScFv单链抗体模板的构建、体外转录与体外翻译、亲和筛选及筛选效率的测定以及分子多样性和体外进化研究,讨论了核糖体展示技术目前的发展动态、存在问题及发展趋势.     

利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法的建立

核糖体展示(ribosomedisplay)是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具.利用体外转录和翻译偶联系统可以方便而快捷地完成核糖体展示.筛选系统利用一对能够紧密结合的蛋白质:人锚蛋白(ankyrin)和红血球膜带3蛋白细胞质区域(cytoplasmicdomainoferythrocytemembraneproteinBand3,Cdb3)作为模式分子,希望利用cdb3蛋白通过核糖体展示亲和选择得到锚蛋白基因.用于核糖体展示的人锚蛋白基因结构由组装PCR构建,通过PCR技术引入核糖体展示所需的结构元件.在亲和筛选步骤后,只能利用红血球膜带3蛋白筛选得到锚蛋白基因,而不能利用对照牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)筛选得到,从而说明建立的核糖体展示技术能够正常发挥作用.     

核糖体展示技术的研究与应用现状

核糖体展示技术是20世纪90年代建立并发展起来的一种完全在体外进行的分子筛选与进化技术,避免了体内展示技术的缺陷,不受细胞转染与基因表达等因素影响,已经成功用于筛选与靶分子特异结合的高亲和力多肽、抗体和酶等.本文主要概述了核糖体展示技术的基本原理、具体步骤、技术改进及应用现状.     

核糖体展示技术

组合化学在分子生物学中的应用,大大提高了所构建分子文库的容量,而高通量筛选技术对于大容量文库的筛选是至关重要的。核糖体展示技术克服了传统筛选技术库容量小和筛选效率低等缺陷。该技术完全在体外进行,其文库容量不受细胞转染效率的影响,库容量和筛选效率得到很大提高,可与其他技术相组合,在体外分子高效表达和定向进化方面具有广泛的应用前景。该文介绍核糖体展示技术的基本原理、技术特点以及最新研究进展。     

利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒 单链抗体基因

目的:利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒特异性单链抗体基因。方法:在已构建好的核糖体展示文库的基础上,利用核糖体展示技术,经过5轮的体外转录、体外转译、亲和筛选和RT-PCR,将得到的序列进行测序分析。结果:筛选到FMDV scFv基因,且基因得到富集。结论:实验运用核糖体展示技术,以FMDV抗原和纯化的146S病毒粒子为靶标筛选到了FMDV scFv基因,将为scFv用于FMD的基础研究、免疫学研究以及为预防、治疗和诊断提供帮助,也为研制FMD的快速诊断技术奠定先前基础。     

核糖体展示研究进展

核糖体展示是一种无细胞系统,可以从文库中筛选蛋白质和多肽。翻译的蛋白质及其mRNA同时结合在核糖体上形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体,通过配体亲和分离得到功能性蛋白及其编码的mRNA,转换成对应的DNA后进行相关蛋白的表达,可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等,而且其可以展示较大的文库而不受细菌转化的限制,可对毒蛋白、蛋白酶敏感和不稳定的蛋白质进行筛选,也可在特定位点进行氨基酸修饰。就核糖体展示技术的研究进展及其在蛋白质进化和筛选方面的应用进行综述。     

利用核糖体展示文库初步筛选与伤寒杆菌Ⅳ型纤毛结合的细胞受体

伤寒杆菌病原毒力岛上的Ⅳ型纤毛与伤寒杆菌的致病性密切相关,但对Ⅳ型纤毛在人巨噬细胞、树突状细胞上的受体及其序列或结合的关键部位还一无所知。本研究拟用核糖体展示库筛选伤寒杆菌结合的细胞受体。体外人工合成引物和含36个随机序列的寡核苷酸,通过两轮PCR构建随机DNA库,随后在体外进行偶联的转录和翻译,得到含随机12肽的核糖体库。利用含随机12肽的核糖体库与体外重组表达的Ⅳ型纤毛结构蛋白(PilS蛋白)进行了初步筛选,为筛选到与伤寒杆菌毒力岛上Ⅳ型纤毛结构蛋白结合的细胞受体奠定了基础。     

基于核糖体展示技术进行抗狂犬病毒人源抗体的制备

构建了核糖体展示人源抗狂犬病毒单链抗体(scFv)库,筛选制备特异抗狂犬病毒糖蛋白(RVGp)的稳定性人源抗体.应用核糖体抗体库技术,从经狂犬病毒Vero疫苗免疫的志愿者外周血淋巴细胞中分离、构建核糖体展示scFv基因库.体外转录翻译后,以RVGp重组蛋白作筛选抗原,采用亲和富集法淘选RVGp特异性scFv抗体基因.在原核系统pET22b(+)/BL21(DE3)中实现scFv抗体片段的可溶性表达,ELISA鉴定阳性克隆.然后对筛选的scFv进行稳定性改构,构建VH-Lc-VK稳定性抗体,并对其生物学活性进行初步研究.成功构建了库容量约为6.2×1012的核糖体展示scFv抗体基因库.在180个筛选克隆中,克隆RB24、RB71、RB109和RB156显示出较高的ELISA值,其基因序列分析结果显示,它们是全新的人源抗RVGp抗体.改构后的抗RVGp VH-Lc-VK抗体的稳定性明显改进,可特异识别RVGp并有效中和狂犬病毒,抑制狂犬病毒对靶细胞的感染.以上结果表明,人源抗RVGp特异性抗体的获得,为狂犬病的有效预防、诊断和治疗提供了新的途径,而且将为其他人源抗体的制备提供理论依据和技术基础.     

分子文库展示技术

分子文库展示技术是一系列广泛应用于多肽、蛋白质及药物筛选和研究蛋白质间相互作用的有效的生物学技术。它将组合成的具有一定长度的随机序列寡核苷酸片段(或cDNA)克隆到特定表达载体中,使其表达产物(多肽片段或蛋白质结构域)以融合蛋白的形式展示在活的噬菌体或细胞表面。根据其蛋白质表达是否依赖于宿主表达系统,分为体内表达展示系统和无细胞展示系统(体外表达展示系统)。就其展示的部位不同又可分为噬菌体展示技术、细胞表面展示技术、核糖体展示技术、mRNA展示技术等。现对各种展示技术的基本原理及相关应用做简要综述。     

体外展示技术研究进展

该文系统阐述了核糖体展示、mRNA展示及DNA展示等体外展示技术的实验原理,并对近年来各种体外展示技术所取得的进展进行了全面的回顾和总结。     

核糖体失活蛋白及核糖体拓扑结构的研究进展（续完）

核糖体失活蛋白及核糖体拓扑结构的研究进展（续完）李向东刘望夷（中国科学院上海生物化学研究所,上海２０００３１）关键词核糖体失活蛋白核糖体拓扑结构ＲＮＡＮ－糖苷酶２．核糖体拓扑结构的研究核糖体是由数十种生物大分子（ＲＮＡ和蛋白质）构成的。早期普遍接受的...     

八肋游仆虫酸性核糖体蛋白基因克隆与特征分析

原核和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类酸性核糖体蛋白,在大肠杆菌中,分别为L10和L7/L12蛋白,而在真核生物中是P0、P1和P2(简称P蛋白)。这些酸性核糖体蛋白共同组成五聚体复合物P0-(P1/P2)2,在大亚基上形成一个向外侧凸出的柄状结构(Ribosomalstalk)。酸性核糖体蛋白位于核糖体的活性部位,一方面     

快速检测核糖体失活蛋白活性质粒的构建及应用

核糖体失活蛋白专一地断裂28S rRNA第4 324位的腺嘌呤与核糖之间的N-糖苷键,具有特异破坏核糖体的结构,抑制蛋白质生物合成的功能。核糖体失活蛋白在医疗方面有极大的应用价值。为了能简单快速筛选出核糖体失活蛋白,本实验构建了一种包含核糖体失活蛋白识别位点的双荧光素酶质粒psiCHECKTM-2-F28RNA。用具有N 糖苷酶活性的苦荞凝集素(tartary buckwheat lectin,TBL)作用于psiCHECKTM-2-F28RNA质粒,电泳检测发现,TBL可以将质粒DNA由超螺旋型切割为缺刻型。将psiCHECKTM-2-F28RNA转染HCT116细胞,发现海肾/萤火虫荧光比值也明显降低,表明构建的质粒可以用于检测核糖体失活蛋白对细胞的毒性作用。当将psiCHECKTM-2-F28RNA中的GAGA序列中腺嘌呤分别突变后进行同样实验,确定该质粒中的GAGA为核糖体失活蛋白的识别位点。进一步构建包含GAGA特征序列的Wnt1-3′UTR区的质粒psiCHECKTM-2-Wnt1-3′UTR,实验也发现,在胞外和胞内TBL与psiCHECKTM-2-Wnt1-3′UTR都具有相互作用,表明细胞内具有GAGA序列的mRNA也可能成为核糖体失活蛋白的靶点。选用几种食源性作物中提取的蛋白质,分别与psiCHECKTM-2-F28RNA作用,进行体外检测,结果显示,该质粒能快速地筛选来源于不同生物的核糖体失活蛋白。这些结果表明,本实验构建的psiCHECKTM-2-F28RNA质粒,可用于核糖体失活蛋白的快速筛选和酶活性鉴定。     

蛋白质体外表达与进化技术

蛋白质体外表达与进化技术包括核糖体展示技术和mRNA展示技术。与蛋白质体内表达系统相比,体外表达技术可产生较大容量的蛋白质文库（约10^12～10^13左右）,同时在回收编码蛋白质的信息时对文库进行了进化,增加了蛋白质文库的多样性,促进了抗体或配体类蛋白质的亲和成熟能力。该文介绍了蛋白质体外表达技术在新蛋白质（如抗体或配体等）表达筛选中的应用。     

核糖体灭活蛋白在植物中的作用

植物核糖体灭活蛋白 (ribosome -inactivatingproteins ,RIPs)能够破坏真核或原核细胞的核糖体大亚基RNA ,使核糖体失活而不能与蛋白质合成过程中的延伸因子相结合 ,从而导致蛋白质合成受到抑制。不同的核糖体对不同RIPs的敏感性不同 ,RIPs对自体或异体核糖体的作用也有很大区别。RIPs对病毒有很强的抑制作用 ,并且有些RIPs表现出对某些真菌和昆虫的抗性 ,因此认为核糖体灭活蛋白在植物的防御反应中扮演重要角色。另外 ,RIPs还可能参与了细胞代谢、细胞死亡等生理调控过程。     

核糖体蛋白的核糖体外功能

核糖体蛋白的核糖体外功能关键词核糖体蛋白功能近年来发现,在核糖体蛋白中存在着可与ＤＮＡ结合的特征结构。人们由此推测,由核糖核酸（ＲＮＡ）转变为核蛋白体的核糖体可能是在ＲＮＡ上添加一些本来就存在的蛋白后形成的。人们还观察到,多种核糖体蛋白除组成核糖体外...     

核糖体展示及体外分子选择与进化

核糖体展示是20世纪90年代中期发展起来的一种简便而有效的体外分子选择与进化技术。它也是第一种完全在体外进行蛋白质或多肽分子选择与进化的方法。本主要概述了体外核糖体展示技术的建立基础、基本原理和技术特点等,并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。     

核糖体失活蛋白—RNA N—糖苷酶

本文概述了双链和单链植物核糖体失活蛋白的基本特性,在分子水平上讨论了核糖体失活蛋白作用于真核细胞核糖体的机制。扼要介绍了免疫毒素及其在癌症治疗中的应用。同时,也讨论了目前有关核糖体失活蛋白的研究状况和今后的发展趋向。     

基因工程抗体研究进展

基因工程抗体技术的发展十分迅速,其应用也极其广泛,本文将介绍核糖体展示、噬菌体表面展示等基因工程抗体技术及应用进展。     

核糖体展示技术在非编码核酸研究中的应用

非编码RNA(non-coding RNA)是一类内源性的不具有蛋白质编码功能的RNA分子,在细胞的生长增殖、发育、核内运输,甚至在肿瘤的发生中发挥着重要的作用。核糖体展示技术(ribosome profiling)是多聚核糖体分离和深度测序技术(deep sequencing)相结合的新兴组学技术,可以精确地测定正在被翻译的转录本并具有组学广度。对非编码RNA研究而言,这既是一个新的高度又是一门新的技术。系统阐述了核糖体展示技术的实验原理、目前研究取得的进展,以及在非编码RNA调控机理中的应用。