稳定表达脑心肌炎病毒先导蛋白N2a细胞系的建立与鉴定

为建立稳定表达脑心肌炎病毒先导蛋白的N_2a细胞系,本研究应用脂质体介导DNA转染法,将表达脑心肌炎病毒(EMCV)先导(L)蛋白的重组质粒pNTAP-B-L转染至N_2a细胞中,通过筛选G418抗性单克隆细胞,建立能够稳定表达融合蛋白TAP tag-L的N_2a细胞系;利用免疫印迹试验(Western blotting)和间接免疫荧光试验(IFA)对融合蛋白TAP tag-L的表达及细胞内定位情况进行鉴定检测。结果表明EMCV的L基因已经整合进N_2a细胞基因组DNA中且L蛋白在获得的阳性N_2a细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-L主要分布在细胞浆内。建立的稳定表达L蛋白的N_2a细胞系,为进一步研究先导蛋白功能及EMCV感染过程中与宿主细胞(N_2a)相互作用蛋白的筛选奠定了基础。     

广东省自然保护区的建设与发展

本文论述了我国及我省自然保护区的发展历程,阐明了建设自然保护区的意义和作用,总结了我省自然保护区建设的成绩及存在问题,着重提出了发展我省自然保护区事业的建议。     

利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒 单链抗体基因

目的:利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒特异性单链抗体基因。方法:在已构建好的核糖体展示文库的基础上,利用核糖体展示技术,经过5轮的体外转录、体外转译、亲和筛选和RT-PCR,将得到的序列进行测序分析。结果:筛选到FMDV scFv基因,且基因得到富集。结论:实验运用核糖体展示技术,以FMDV抗原和纯化的146S病毒粒子为靶标筛选到了FMDV scFv基因,将为scFv用于FMD的基础研究、免疫学研究以及为预防、治疗和诊断提供帮助,也为研制FMD的快速诊断技术奠定先前基础。     

核糖体展示口蹄疫单链抗体库的构建

目的:构建库容量大、多样性好的核糖体展示口蹄疫单链抗体(scFv)库。方法: 分离口蹄疫病毒免疫的兔脾细胞,提取总RNA,用RT-PCR扩增兔抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因,同时扩增作为间隔区的兔抗体Ck基因;采用重叠延伸PCR (简称SOE-PCR)技术连接VH-VL基因,同时引入T7启动子和核糖体结合位点序列,体外构建核糖体展示scFv库模板,连接pMD18-T载体转化E.coli DH5α大肠杆菌,挑取阳性克隆测序以鉴定scFv组装。结果:成功构建了库容量达8.21×10¹³的兔源口蹄疫核糖体展示scFv库。结论: 构建的大容量兔源性口蹄疫核糖体展示抗体库可以成为进一步筛选特异性口蹄疫单链抗体的实验平台,为开发诊断性口蹄疫单链抗体奠定了很好的实验基础。