ARTP诱变选育鼠李糖脂高产菌及鼠李糖脂促进枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究

旨在选育鼠李糖脂高产菌株,以实验室筛选的产鼠李糖脂的Pseudomonas aeruginosa C3为出发菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP),选育出一株高产突变株Pseudomonas aeruginosa SC-11,产量比出发菌株提高了74.1%。进一步对产鼠李糖脂的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了优化,优化后的鼠李糖脂产量达42 g/L,底物转化率达到0.7 g/g底物。添加0.01%鼠李糖脂到Bacillus subtilis CL产羧甲基纤维素酶与木聚糖酶的培养基中,羧甲基纤维素酶活与木聚糖酶活分别提高12.9%和18.3%。研究表明,鼠李糖脂通过增加细胞通透性来提高胞外酶产量。     

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响

为研究发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响,从鼠李糖脂的结构组分、性能和应用效果等方面展开研究。薄层实验证明两种鼠李糖脂均含有单糖脂和双糖脂。液质分析发现以橄榄油作碳源时,鼠李糖脂中双糖脂(Rha-Rha-C5-C6:1和Rha-Rha-C8-C8:2)比例更大,约为73.09%。而地沟油作碳源时,单糖脂(Rha-C10-C10和Rha-C16-C16:2)的比例更高,约为76.91%。橄榄油和地沟油为碳源的鼠李糖脂的临界胶束浓度(CMC)分别为55 mg/L和80mg/L。相同投加量时,前者乳化性和乳化稳定性均优于后者。NY3菌降解含油污泥时,投加双糖脂含量高的鼠李糖脂会使C16-C30直链烷烃的去除率更高。     

以甘油为底物鼠李糖脂高产菌株的诱变选育

通过诱变选育,将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)RG-14利用甘油发酵生产鼠李糖脂产量由13.6g/L提高到16.5 g/L。突变株经过5次连续传代培养,菌株仍维持稳定的鼠李糖脂产量,表明该菌株具有较好的遗传稳定性。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析诱变后菌株发酵甘油生产鼠李糖脂的组成,结果显示鼠李糖脂由Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12组成,其中单、双鼠李糖脂的相对丰度分别为54.8%和45.2%。当以工业粗甘油代替精甘油为底物时,该菌株鼠李糖脂产量达到14.2 g/L,表明其具有较好的应用潜力。     

预水解发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3产鼠李糖脂特性及应用效能的影响研究

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3(Pseudomonas aeruginosa NY3)产鼠李糖脂(Rhamnolipids,Rha)的特性影响较大。研究了利用废弃动物油作为发酵碳源时,其碱预水解和酶预水解对NY3菌发酵产鼠李糖脂产量、产物结构和性能的影响,从碳源水解酸值与水解产物、鼠李糖脂组分结构和实际应用效果进行了研究。碱、酶预水解实验发现,碳源酸值由初始的19.81 mg/g分别提高到72.04 mg/g和73.75 mg/g,气质联用(GC-MS)分析检测结果表明,碱、酶预水解后,碳源均释放7种C14-C18碳链的脂肪酸,鼠李糖脂产量由未预水解的8.28 g/L分别提高到15.35 g/L和17.63 g/L。液质联用(LCMS-IT-TOF)分析结果表明,用未预水解及碱、酶预水解碳源发酵时,NY3菌所产鼠李糖脂中单糖脂含量分别为62.07%、65.67%、87.32%。利用NY3菌在中试条件下处理高浓度石化企业油污泥,发现鼠李糖脂能促进NY3菌去除油污泥中的石油烃,且促进作用强弱顺序为未预水解产Rha碱预水解产Rha酶预水解产Rha。     

产鼠李糖脂生物表面活性剂大肠杆菌的构建与优化

目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得,从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌,将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhl AB)以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhl AB基因和rha BDAC基因簇(TDP-L-鼠李糖合成的基因簇)进一步利用合成启动子进行组合调控,筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化,鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L,是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵,12h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。     

废弃食用油脂生物合成鼠李糖脂研究进展

碳源的成本过高限制了鼠李糖脂的工业化生产及应用,废弃食用油脂作为一种廉价易得的碳源,越来越多的研究者开始关注用它发酵生产鼠李糖脂.废弃食用油脂的种类、投加量对鼠李糖脂的产量、结构、性质均会产生影响,目前研究中用废弃食用油脂作碳源,鼠李糖脂产量最高可达24.61g/L、表面张力最低达到24mN/m、产物CMC最低可达40.19mg/L.此外,本文还总结了菌株、氮源、微量元素、pH、溶氧及培养方式等因素对废弃食用油脂生产鼠李糖脂的影响,并展望了利用废弃食用油脂生产鼠李糖脂实现产业化的重点研究方向.     

响应曲面法优化铜绿假单胞菌DN1的产鼠李糖脂条件

鼠李糖脂是近年来具有广阔应用前景的生物表面活性剂之一,因应用范围广和环境友好等特点,使其成为潜在的合成表面活性剂的替代品。本研究以一株能产生鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DN1为研究对象,采用Plackett-Burman设计和响应曲面方法(RSM)对其产鼠李糖脂的发酵条件进行优化。Plackett-Burman试验设计表明,磷酸盐、C/N比和p H值对鼠李糖脂的产量具有显著影响。在此基础上,采用RSM对3个显著因素的最佳水平范围进行研究,结果表明当磷酸盐为1.71 g/L、C/N比为15.5、p H值为6.5时,其理论最佳鼠李糖脂产量为40.4 g/L,与实测鼠李糖脂产量39.84 g/L非常接近。摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的22.9 g/L提高了73.97%。     

铜绿假单胞杆菌O-2-2产鼠李糖脂的发酵培养基优化及LC-MS/MS分析

鼠李糖脂是一种性能优良的生物表面活性剂,在生物医药、环境保护、二次采油等方面具有很高的应用潜力.采用响应面分析法,对铜绿假单胞杆菌O-2-2的培养基进行了优化.Plackett-Burman(PB)实验设计表明,磷酸盐、硝酸盐和微量元素对鼠李糖脂的产量具有显著影响.Box-Behnke (BB)优化确定最佳培养基组成为磷酸盐、硝酸盐和微量元素用量分别为3.2g/L、13.76g/L和5.17ml,理论的最大产量为8.48g/L,与实测糖脂产量8.85g/L接近.摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的6.24g/L提高了30.8％.最优化条件下采用10％的接种量逐级放大,并通过补料发酵,最终200L罐的鼠李糖脂产量达到70g/L,发酵时间仅为110h.采用新发明的二次蒸馏工艺,鼠李糖脂纯度达86.6％.液质联用(LC-MS)分析表明所生产的鼠李糖脂成分及含量为:双糖单脂32.9％、双糖双脂17.02％、单糖单脂3.16％、单糖双脂33.54％.     

9株海洋来源铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的比较分析

目的:从海洋来源的铜绿假单胞菌中筛选多株具有鼠李糖脂合成能力的菌株。方法:以9株分离自不同海洋环境的铜绿假单胞菌为研究对象,考察并比较其发酵合成鼠李糖脂生物表面活性剂的表面活性、产量和产物成分的差异,扩增并比对合成途径中的关键基因。结果:9株菌的发酵产物均具有表面活性,其中菌株1A01151发酵液的表面活性最强,表面张力值可降低至28 m N/m;9株菌的基因组中均含有鼠李糖脂合成途径中关键基因rhl AB和rhl C,都具有合成单、双鼠李糖脂的能力;菌株1A01151和1A00364的发酵产量最高(2.69 g/L),产物经LC-MS/MS检测,所合成的鼠李糖脂同系物组分不同,双糖双脂的含量最高(1A01151:75.96%;1A00364:61.01%)。结论:海洋来源的铜绿假单胞菌是具有鼠李糖脂高产潜力的菌株,可用于合成性能不同、组成多样的鼠李糖脂生物表面活性剂。     

铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选

从多种来源筛选高产鼠李糖脂的菌株,并研究菌种发酵特性和鼠李糖脂产物的理化性质。采用CTAB平板初步筛选鼠李糖脂合成菌株,通过分析菌株的16S r RNA基因序列确定细菌种属,采用薄层色谱、红外光谱分析产物性质。结果显示,利用CTAB平板初筛获得163株阳性菌株,初步发酵确定10株高产细菌鼠李糖脂的产量为12.2-17.7 g/L,10株细菌均鉴定为铜绿假单胞菌。挑选产量最高的菌株B12,分别以甘油、菜籽油、花生饼粉或葵花籽饼粉为碳源进行发酵,发现菜籽油为合成鼠李糖脂的最佳碳源。进一步对比在35℃、37℃和40℃的发酵水平,发现37℃条件下鼠李糖脂产量最高,为26.8 g/L。最后,对鼠李糖脂发酵产物进行了初步纯化,并进行了薄层色谱和红外光谱分析。菌株B12能够合成较高水平的鼠李糖脂,可能成为工业生产的候选菌株。     

一株产鼠李糖脂菌株的筛选、鉴定及其产物特性分析

鼠李糖脂是最常见,研究最深入,应用最广泛的一类生物表面活性剂。从油田附近、沼气池旁的土壤中分离得到了25株菌,通过硫酸-苯酚反应,乳化实验,排油性实验,薄层色谱实验筛选产鼠李糖脂的菌株并表征产生的鼠李糖脂,通过16S r DNA序列确定细菌的种属。硫酸-苯酚反应显示有2株菌可能产鼠李糖脂;5株菌的发酵液具有明显的乳化效果,命名为"其红"这株菌的乳化指数可达58.97%;1株菌的发酵液上清稀释10倍后排油圈直径仍可达3.53 cm;薄层色谱实验也显示"其红"菌产鼠李糖脂。在四个实验中"其红"菌都检测到了鼠李糖脂,故确认"其红"菌可以产鼠李糖脂。16S r DNA序列分析表明"其红"菌属于希瓦氏菌属(Shewanella)并与腐败希瓦菌(S.putrefaciens LMG 26268(T))相似度最高。     

1株耐高温生物表面活性剂产生菌的特性研究

研究了耐高温生物表面活性剂产生菌ZY-3的生理生化特性,并通过测定发酵液的菌体密度、表面张力和乳化活性等指标,研究不同碳源和初始pH对菌株ZY-3生长和产生物表面活性剂的影响,同时对其所产生物表面活性剂进行了初步分离和性质分析。菌株ZY-3被初步鉴定为芽胞杆菌属(Bacillus),具有产酸、不产H_2S、还原硝酸盐等特性。在以淀粉为碳源、初始pH 6.0的培养基中发酵,产生物表面活性剂多且稳定;在种子培养基和发酵培养基中都有淀粉的条件下,菌体生长较多,降低表面张力和乳化的作用均较强,所产生物表面活性剂可以使发酵液的表面张力从72.1 mN/m降到53.1 mN/m,乳化活性从0升高到24%。初步判断产物为糖脂类阴离子表面活性剂。     

铜绿假单胞菌XJ601产鼠李糖脂的优化培养及其稳定性

以1株从原油污染样品中分离获得的铜绿假单胞菌XJ601为研究对象,采用蒽酮比色法定量分析鼠李糖脂,优化其产鼠李糖脂的培养基组成。研究表明:疏水性底物优于亲水性底物,具有更高的鼠李糖脂产量,尤以菜籽油最佳;氮源中,硝酸盐、NH_4Cl能促进鼠李糖脂的合成,以菜籽油为碳源时,最佳氮源为NaNO_3;C/N比值在20时,鼠李糖脂产量最高;P元素的微量添加会影响鼠李糖脂的合成。摇瓶培养获得的鼠李糖脂对不同温度、pH及NaCl浓度都具有较好的稳定性,表明其在三次采油及原油污染生物治理等领域具有较好的应用前景。     

碱预处理玉米芯米根霉同步糖化发酵产富马酸

以碱预处理玉米芯渣为原料,采用单因素优化方法优化米根霉同步糖化发酵产富马酸。在此基础上,研究米根霉利用碱预处理玉米芯渣的同步糖化发酵,并与纯糖发酵进行对比。结果表明:在50 g/L底物、(NH4)2SO4质量浓度0.71 g/L、纤维素酶用量20 FPIU(以1 g纤维素计)、Ca CO3加入量30 g/L、接种量10%(体积分数)和装液量50 m L的条件下,米根霉同步糖化发酵过程产富马酸13.78 g/L,而纯糖发酵富马酸生成量仅6.21 g/L。     

不同结构配比的鼠李糖脂乳化活性与油泥清洗效果

以大庆油田原油和含油污泥为对象,研究不同结构配比鼠李糖脂表面活性剂乳化活性及其对含油污泥清洗效果的影响,并优化清洗工艺参数。结果表明:单鼠李糖脂比例越高,其表面活性越好;双鼠李糖脂比例越高,其对原油的乳化能力越强;临界胶束浓度随着双鼠李糖脂比例的增加而逐渐加大;单、双鼠李糖脂配比不同的表活剂对油泥的清洗效果也不同,质量比为50∶50时清洗效率最高;鼠李糖脂浓度为1.0 g·L^-1、热洗时间为1.5h、热洗温度为65℃、洗脱强度为220 r·min^-1、固液质量比为1∶5条件下,油泥的清洗效率最高,可达81.3%;含油率为29.6%的落地油泥,经一级洗涤后油泥残油率降至5.5%,原油回收率达到87.3%,清洗出的原油无明显乳化,易于分离。由此可知,鼠李糖脂的单、双糖脂比例不同对其理化性质和清洗含油污泥的效果均有不同程度的影响。     

鼠李糖脂产生菌M7-6在模拟油藏条件下的培养基优化

基于已筛选出的鼠李糖脂产生菌M7-6,在模拟油藏条件(温度、pH、矿化度及缺氧)下,对该菌株的激活剂配方进行了碳源、氮源、碳氮比(C/N)、无机盐等因素的优化,并考察了该菌株在模拟油藏条件下的最佳接种量;利用厌氧发酵罐对菌株M7-6进行了扩大培养,评价菌M7-6的原位代谢活性及与其他微生物类群的竞争作用。结果表明:以甘油为碳源、硝酸盐为氮源、C/N为14.4∶1时,最利于菌株M7-6在模拟油藏条件下生产鼠李糖脂,最小接种量为1%(体积分数)。在厌氧发酵罐中,菌株M7-6可以将培养体系的表面张力降至38.4 mN/m;并且体系中烃降解菌和产酸菌数量有所增加,而硫酸盐还原菌数逐渐减少。     

一株铜绿假单胞菌及其产生的鼠李糖脂特性研究

研究高效代谢表面活性剂的菌种,并对菌种和表面活性剂的理化性质进行分析。采用菌种16S rDNA序列分析对菌种进行鉴定,采用紫外光谱扫描、色谱柱层析、薄层层析、单糖分析对生物表面活性剂的种类进行鉴定,并对表面活性剂的理化性质进行研究。从油田采出水中筛选出一株高效代谢生物表面活性剂的菌株T-1,经16S rDNA鉴定为铜绿假单胞菌属(Pseudomonas aeruginosa)。该菌种以甘油和大豆油为碳源的培养基培养4 d后,其发酵液表面张力30.216 mN/m,EI24为100%。根据表面活性剂的红外光谱分析并结合薄层分析,可确定T-1样品中含有糖脂类物质,进一步的表面活性剂的单糖分析显示水解终产物为单一的鼠李糖,最终确定其产物为鼠李糖脂,苯酚-硫酸法测定其鼠李糖脂产率为5.2 g/L,从发酵液提取的棕黄色生物表面活性剂粗品,其表观临界胶束浓度为45 mg/L,该鼠李糖脂对环境(耐温、耐酸碱、耐盐)具有较强的适应性。该表面活性剂对恶劣环境具有较强的耐受性,可应用于微生物采油等用途。     

常压甘油自催化预处理麦草浓醪发酵纤维素乙醇

目前纤维素乙醇成本偏高的根本原因在于没有达到淀粉质乙醇发酵水平的"三高"(高浓度、高转化率和高效率)指标,提高水解糖液浓度和避免发酵抑制物来实现浓醪发酵,是解决问题的关键。文中以常压甘油自催化预处理麦草为底物,尝试采用不同发酵策略,探讨其浓醪发酵产纤维素乙醇的可行性。在优化培养条件(15%底物浓度,加酶量30 FPU/g干底物,温度37℃,接种量10%)下同步糖化发酵72 h,纤维素乙醇产量为31.2 g/L,转化率为73%,发酵效率0.43 g/(L·h);采用半同步(预酶解24 h)糖化发酵72 h,纤维素乙醇浓度达到33.7 g/L,转化率为79%,发酵效率为0.47 g/(L·h),其中(半)同步糖化发酵中90%以上纤维素已被糖化水解用于发酵;采用分批补料式半同步糖化发酵,补料到基质浓度相当于30%,发酵72 h时纤维素乙醇产量达到51.2 g/L,转化率为62%,发酵效率为0.71 g/(L·h)。在所有浓醪发酵中乙酸不足3 g/L,无糠醛和羟甲基糠醛等发酵抑制物。以上结果表明,常压甘油自催化预处理木质纤维素基质适用于纤维素乙醇发酵;分批补料式半同步糖化发酵策略可用来进行浓醪纤维素乙醇发酵;未来工作中提高基质纯度和强化酶解产糖是浓醪纤维素乙醇达到"三高"指标的关键。     

酶水解菊芋糖浆发酵生产琥珀酸的初步研究

用产菊粉酶的一株黑曲霉菌株进行产酶发酵条件和水解条件研究,在30℃,pH 6.0,摇床转速200 r/min,发酵时间为3 d的最适产酶条件下,酶活可以达到45.9 U/mL.以总糖含量为85.2 g/L的菊芋粉为初始底物,最适酶水解条件为温度50℃,加黑曲霉培养液的量为10%(v/v),水解12 h后,水解率达到99.6%.用此酶解液在5 L搅拌发酵罐中进行琥珀酸发酵,初始还原糖浓度53.5 g/L,36 h发酵产琥珀酸43.8 g/L,琥珀酸产率0.83 g/g,糖利用率99.0%,琥珀酸生产强度1.22 g/(L·h).     

假单胞菌L-11产生生物表面活性剂发酵条件的优化

确定了假单胞菌L-11用葡萄糖为底物产生生物表面活性剂的最适发酵培养基组成和发酵条件。在1L的发酵罐中,L-11的发酵液（10％）与原油的界面张力可以达到5.3×10-3mN/m。该产品可以用于微生物提高原油采收率的实验研究。对其放大工艺也进行了初步的研究。