柯萨奇病毒B3型3D蛋白抗体的制备

肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶。柯萨奇病毒B3型(coxsackievirus B3,CVB3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚。本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVB 3D片段插入pET28a(＋)的表达框,获得pET28a(＋)-3D重组质粒。异丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导pET28a(＋)-3D表达3D-His蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,切胶,获得3D-His蛋白。3D-His蛋白加佐剂免疫新西兰大白兔制备3D蛋白多克隆抗体,蛋白免疫印迹法检测抗体效价及特异性。结果显示,本研究获得了高效价且特异性好的抗CVB3 3D蛋白抗体,可用于CVB3 3D蛋白功能的后续研究。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在致瘤病毒感染研究中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9),CRISPR/Cas9〕基因编辑技术的发现源于真细菌和古细菌中CRISPR/Cas系统介导的适应性免疫机制研究。该技术利用特异性向导RNA识别靶点基因,引导核酸内切酶Cas9对其切割,并通过同源重组或非同源末端连接完成对目的DNA的编辑。某些病毒感染机体后,可将其基因组整合到宿主细胞基因组中或潜伏于组织中而无法被彻底清除,从而引起持续性感染。本文参考2013年以来CRISPR/Cas9基因组编辑技术的最新相关研究报道,重点综述其在人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV )、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、 Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)等致瘤病毒感染相关疾病研究中的应用,并概括其作用于这些病毒的有效靶点。     

柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组RNA存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′ cDNA末端快速扩增技术(5′ rapid amplification of cDNA ends,5′ RACE)扩增并克隆细胞内CVB3基因组片段,并对每条序列及其5′端的二级结构进行分析。结果获得的20条CVB3基因组片段,长度为 2 067～5 547 bp,片段断端主要分布于2Apro和2C编码区。RNAfold分析显示,这些片段多数在5′断点端形成二级茎-环结构。本研究显示,CVB在宿主细胞感染时可形成大量不完整基因组RNA片段,这些片段可在5′断点端形成局部双链结构,提示片段不是随机产生,可能是RNA酶剪切产物。此发现有助于理解CVB基因组不稳定的机制。     

HBV YIDD变异株真核表达载体的构建及鉴定

构建HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株的全基因真核表达载体,为进一步深入探讨乙型肝炎病毒拉米夫定耐药的分子机制,寻求耐药后的有效治疗奠定基础。以重组质粒PMD18T-HBV-C为模板,采用PCR扩增HBV C基因型YIDD变异株的全基因组DNA,并将其定向克隆于真核表达载体PcDNA3.1( )中。获得的真核表达重组质粒PcDNA3.1( )-HBV-C(YIDD)通过酶切后电泳及测序进行鉴定。琼脂糖电泳结果证实PCR产物大小约为3.2 kb,与预期相同。酶切及测序结果证实,HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株全基因真核表达载体PcDNA3.1( )-HBV-C(YIDD)构建成功。